不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)miR-146a-5p的臨床意義及其膽固醇代謝途徑的調節(jié)作用.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)miR-146a-5p的臨床意義
　　目的:觀察循環(huán)miR-146a-5p在不穩(wěn)定型心絞痛(UA)患者和健康志愿者血漿中表達變化情況。
　　方法:連續(xù)入選自2012年9月至2012年12月就診于唐山工人醫(yī)院心內科的近3個月未經(jīng)他汀類藥物治療并行冠狀動脈造影檢查證實的UA患者23名。另選擇28名年齡、性別、臨床主要危險因素相匹配的并經(jīng)冠狀動脈造影證實冠

2、脈正常的相對健康人群作為正常對照組。實時定量RT-PCR方法檢測各受試者血漿miR-146a-5p循環(huán)水平，并應用受試者工作曲線（ROC曲線）分析血漿miR-146a-5p水平變化對UA的臨床診斷價值。
　　結果:UA組患者主要臨床特征，包括年齡、性別、吸煙、高血壓病史、血脂水平較健康對照組均無顯著差異（P＞0.05）。以miR-423-5p為內參，應用Taqman熒光實時定量RT-PCR方法分別檢測健康對照組和UA組受試者血漿m

3、iR-146a-5p循環(huán)水平，結果顯示UA組患者血漿miR-146a循環(huán)水平，較健康對照組顯著性下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。通過ROC曲線分析，UA組miR-146a-5p曲線下面積(AUC)為0.997(95％ CI，0.9886-1.005，P＜0.0001)，其高特異性和靈敏度度，提示miR-146a-5p循環(huán)水平對UA患者人群具有潛在的臨床診斷應用價值。
　　結論:在本實驗中，相對健康對照組，miR-146

4、a-5p在UA患者血漿中的循環(huán)水平顯著性下降，研究結果提示炎癥及免疫調節(jié)相關miR-146-5p參與了UA的病理過程。其對UA患者人群的診斷、預后評價方面具有潛在的臨床應用價值。
　　第二部分 P.g-LPS、AGE-BSA上調PMA誘導THP-1巨噬細胞miRNA-146a基因表達
　　目的:既往大量研究證實，細菌脂多糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物均能刺激單核巨噬細胞炎癥反應，成為觸發(fā)和促進動脈粥樣硬化進程的關鍵因子。同時，miR

5、NA-146a在細胞增殖、凋亡和分化所伴隨的炎癥反應調控中扮演重要的角色。然而miRNA-146a是否參與細菌脂多糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導的THP-1源性巨噬細胞炎癥反應卻罕見報道。本研究的目的是觀察體外Pg-LPS(以下簡稱LPS)和AGE-BSA刺激條件下，巨噬細胞miR-146a-5p表達水平變化情況。
　　方法:將不同孔細胞隨機分為轉染對照組，LPS組，AGE組和miR-146a-5p轉染組。LPS與AGE組分別在加入相

6、應濃度LPS（1μg/mL）和AGE-BSA(100μg/mL)，刺激PMA誘導的THP-1巨噬細胞。應用熒光實時定量RT-PCR方法檢測各組miR-146a-5p表達水平。
　　結果:以miR-146a-5p轉染組為陽性對照，以轉染對照組為陰性對照，LPS、AGE-BSA刺激PMA誘導的THP-1巨噬細胞24 h后，miR-146a-5p表達水平均被顯著顯著性上調，分別升高了約9倍(P＜0.01)和2.3倍(P＜0.05)，差異

7、有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結論:內源性致炎性因子AGEs和外源性致炎性因子LPS均能上調PMA誘導的THP-1巨噬細胞miR-146a-5p的表達，提示miR-146a-5p在體內外致炎性因子的抗炎性反應中發(fā)揮著重要作用。
　　第三部分 miRNA-146a-5p負向調控LPS和AGE誘導的THP-1巨噬細胞ABCA1、ABCG1蛋白水平變化
　　目的:膽固醇代謝途徑關鍵蛋白ABCA1和ABCG1在不穩(wěn)定型心絞痛的病理進

8、程中發(fā)揮著重要作用。而UA動脈粥樣硬化性病灶的慢性炎癥反應與膽固醇代謝調節(jié)途徑的具體作用機制尚不明確。大量研究證實miRNA-146a在細胞增殖、凋亡和分化所伴隨的炎癥反應調控中扮演重要的角色。然而miRNA-146a是否能夠調控由LPS和AGE-BSA誘導的ABCA1/ABCG1蛋白表達尚不清楚。本研究旨在是觀察LPS、AGE-BSA及miR-146a-5p對THP-1巨噬細胞ABCA1和ABCG1蛋白表達變化的影響作用。
　　

9、方法:將不同孔細胞隨機分為轉染對照組，LPS組，AGE組，miR-146a-5p轉染組，LPS+miR-146a組和AGE組+miR-146a組。含有LPS與AGE-BSA組于miR-146a-5p轉染24 h后分別加入相應濃度LPS(1μg/mL)和AGE(100μg/mL)，再持續(xù)刺激6h，采用Western blotting免疫印跡法檢測各組ABCA1和ABCG1蛋白表達水平。
　　結果:同對照組相比，miR-146a-5p

10、單獨轉染組PMA誘導的THP-1巨噬細胞ABCA1、ABCG1蛋白水平無明顯變化(P＞0.05);而LPS組ABCA1、ABCG1蛋白表達水平均被顯著性上調(P＜0.05);AGE-BSA組ABCA1、ABCG1蛋白表達水平均被顯著性下調(P＜0.05)。與LPS組相比較，LPS+miR-146a共刺激組ABCA1和ABCG1蛋白水平被顯著性下調(P＜0.05);而與AGE-BSA組相比較，AGE-miR-146a共刺激組ABCA1和A

11、BCG1蛋白水平均被顯著性上調(P＜0.05)。
　　結論:內源性致炎性因子AGEs和外源性致炎性因子P.g-LPS均能影響巨噬細胞膽固醇代謝關鍵調節(jié)蛋白ABCA1和ABCG1的基因表達，但其作用截然相反;在非致炎性條件下，miR-146a-5p對巨噬細胞ABCA1和ABCG1均無作用，然而體外模擬增加miR-146a-5p水平能夠逆轉致炎性因子所誘導的ABCA1和ABCG1基因表達變化。為研究miRNA、炎性反應、膽固醇代謝途徑

12、間的交互作用研究，提供了新的科學依據(jù)和思路。
　　第四部分 miR-146a-5p通過靶向抑制IRAK-1調節(jié)巨噬細胞ABCA1、ABCG1表達
　　目的:從上述實驗中我們觀察到LPS、AGE能夠誘導THP-1源性巨噬細胞ABCA1、ABCG1蛋白表達水平變化，且miRNA-146a可以逆轉該作用，但其可能機制尚未明確。本研究目的是觀察LPS，AGE-BSA和miRNA-146a對炎性調節(jié)因子IRAK-1和膽固醇代謝關鍵調控

13、因子LXRα/β蛋白表達水平的影響。
　　方法:將不同孔細胞隨機分為轉染對照組，LPS組，AGE組，miR-146a-5p轉染組，LPS+miR-146a組和AGE組+miR-146a組。含有LPS與AGE-BSA組于miR-146a-5p轉染24 h后分別加入相應濃度LPS(1μg/mL)和AGE(100μg/mL)，再持續(xù)刺激6h，采用Western blotting免疫印跡法檢測各組IRAK-1和LXRα/β蛋白表達水平。<

14、br>　　結果:與轉染對照組相比較，單純miR-146a-5p轉染組IRAK-1蛋白水平顯著性降低（0.44±0.05 vs0.72±0.21，P＜0.05）;同對照組（0.72±0.21）相比，LPS組IRAK-1蛋白表達水平（1.04±0.24）顯著性升高(P＜0.05);而LPS+miR-146a共刺激組（0.66±0.24）較LPS組IRAK-1蛋白水平被顯著性降低（P＜0.05）。同對照組相比，AGE-BSA組IRAK-1蛋白

15、表達水平被顯著性升高(0.61±0.09 vs0.49±0.02，P＜0.05);同AGE-BSA組比較發(fā)現(xiàn)，AGE-B SA+miR-146a共刺激組IRAK-1水平被顯著性減低(0.38±0.08 vs0.61±0.09，P＜0.01)。與對照組相比較，LPS和AGE-BSA組巨噬細胞LXRα/β蛋白表達水平均無顯著性變化（P＞0.05）。
　　結論:在LPS或AGEs介導的巨噬細胞ABCA1和ABCG1上調或下調作用中，IR

16、AK-1的蛋白水平均被顯著性升高;體外模擬增加細胞內miR-146a-5p水平后，抑制了LPS或AGEs介導的巨噬細胞IRAK-1的上調作用，說明miR-146a-5p能夠靶向抑制LPS或AGEs介導的IRAK-1的上調作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a不僅靶向抑制了炎性因子誘導的IRAK-1的上調作用，同時也逆轉了LPS或AGEs刺激條件下ABCA1和ABCG1的異常改變，提示miR-146a-5p可以通過負向調控靶基因IRAK-1