魚類過(guò)敏原的鑒定和通用檢測(cè)方法的研究.pdf

1、魚味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛,但其同時(shí)也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織公布的8種最常見的高過(guò)敏活性食物之一。本論文以我國(guó)市場(chǎng)上常見的幾種魚為研究對(duì)象,主要從魚過(guò)敏原蛋白的分離、表位預(yù)測(cè)、抗體的制備、通用檢測(cè)方法建立等方面進(jìn)行研究,得到如下結(jié)論。
　　 1.對(duì)五種不同品種的魚蛋白抽提物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,發(fā)現(xiàn)這五種魚抽提物中的蛋白組成、含量均有差異。使用同一對(duì)魚過(guò)敏的陽(yáng)性血清進(jìn)行的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,這五種

2、魚中能與陽(yáng)性血清IgE結(jié)合的蛋白條帶也不同。其中,鯖魚中能引起過(guò)敏的蛋白條帶最多。
　　 2.使用5個(gè)不同患者血清對(duì)鯖魚蛋白抽提物進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)不同患者對(duì)鯖魚中過(guò)敏原蛋白的識(shí)別不同,其中識(shí)別率最高的是分子量為28kDa的一種蛋白,5個(gè)患者血清均能夠與其反應(yīng)。肽質(zhì)量指紋圖譜分析鑒定結(jié)果顯示其為磷酸丙糖異構(gòu)酶。由于其他非魚生物體內(nèi)的磷酸丙糖異構(gòu)酶也曾作為過(guò)敏原被報(bào)道,所以魚中的磷酸丙糖異構(gòu)酶也很可能是一種過(guò)敏原。
　　

3、 3.從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索21種不同品種魚小清蛋白相關(guān)信息,運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析研究其氨基酸同源性。結(jié)果表明不同魚小清蛋白的氨基酸同源性在51.4％和89.9％之間,其中在區(qū)域(51-74和85-104)中,小清蛋白序列相對(duì)保守,各小清蛋白之間差異相對(duì)較小。而在其他區(qū)域,小清蛋白氨基酸序列相差較大。這也解釋了不同魚之間交叉反應(yīng)率不是很高的原因。
　　 4.在國(guó)內(nèi)外首次利用生物信息學(xué)方法對(duì)魚過(guò)敏原小清蛋白的抗原表位進(jìn)行

4、了預(yù)測(cè)。綜合運(yùn)用了多種預(yù)測(cè)方法,對(duì)小清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。得到了不同小清蛋白中一個(gè)通用的抗原表位位點(diǎn),該表位位于小清蛋白87-101的肽段上。
　　 5.對(duì)預(yù)測(cè)所得的表位小肽進(jìn)行了Fmoc固相合成,并使用dot-blot實(shí)驗(yàn)對(duì)其活性進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果表明該表位小肽對(duì)鯉魚,鯖魚,牙鲆魚,鱈魚,沙丁魚,黃花魚均具有致敏活性。因此,可以認(rèn)定該表位即為不同種小清蛋白通用的IgE結(jié)合位點(diǎn)。但該通用表位是否是每

5、種小清蛋白主要的表位,仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。
　　 6.以小清蛋白通用表位小肽為抗原,通過(guò)免疫新西蘭大白兔,制備了小清蛋白通用表位的抗血清,經(jīng)純化后的抗血清效價(jià)可達(dá)1:51200。該抗體與多種魚的小清蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng),可以應(yīng)用于后續(xù)對(duì)魚類過(guò)敏原的檢測(cè)中。
　　 7.以上述獲得的單表位抗體為檢測(cè)材料,初步建立起魚類過(guò)敏原的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫(Ci-ELISA)檢測(cè)方法,該方法檢測(cè)牙鲆魚的檢測(cè)限為1.30ng/mL,線性范

6、圍為5.03ng/mL～16.71ug/mL:孔間變異系數(shù)為6.6～8.2％,板間變異系數(shù)為10.6～17.71％?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,其適用于對(duì)多種魚的過(guò)敏原進(jìn)行通用檢測(cè)。
　　 8.使用同一引物,對(duì)多種魚小清蛋白基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度的不同,實(shí)現(xiàn)了對(duì)鯉魚、牙鲆魚、鯖魚的區(qū)分。在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)出了針對(duì)這3種魚特異的檢測(cè)探針,并使用核酸芯片技術(shù)對(duì)這3種魚進(jìn)行了魚種鑒定。為后續(xù)進(jìn)一步使用核酸芯片技術(shù)進(jìn)行魚種進(jìn)行