埃他卡林對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用及其分子機(jī)制.pdf

1、腦血管疾病是威脅人類健康的重大疾病之一,具有高死亡率,高發(fā)病率和高并發(fā)癥發(fā)生率的特點(diǎn)。調(diào)查顯示全世界每年大約有795,000名的人群受到其危害,其相關(guān)治療費(fèi)用更是高達(dá)68.9億美元。其中約70％為缺血性腦血管疾病。我國(guó)是腦血管疾病的高發(fā)國(guó)之一,并且近20年來其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì),腦血管疾病已成為我國(guó)人口的第二大死亡原因。目前針對(duì)其臨床治療的藥物療效有限,亟需研發(fā)具有新作用靶點(diǎn)和作用途徑的缺血性腦血管疾病治療藥物。
　　缺氧腦損傷

2、的主要病理改變是腦缺氧導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,從而影響腦功能,在此過程中神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞以及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞自身的損傷、壞死和凋亡以及相互的影響是腦組織損傷過程的細(xì)胞變化基礎(chǔ)。隨著近年來醫(yī)學(xué)界對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞形態(tài)和功能的再認(rèn)識(shí),神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)概念逐步得到醫(yī)學(xué)界的認(rèn)同。所謂NVU,是指由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及維持腦組織完整性的細(xì)胞外基質(zhì)和他們之間的相互作用和相互聯(lián)系

3、構(gòu)成的一個(gè)整體概念。NVU擴(kuò)充了血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的內(nèi)涵與外延,具有多種細(xì)胞組成的動(dòng)態(tài)微環(huán)境結(jié)構(gòu)特征。NVU與缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系,其作為一個(gè)功能模塊,已日益成為治療腦缺氧損傷研究的重要靶點(diǎn)之一。
　　ATP敏感性鉀離子通道(KATP通道)是細(xì)胞膜上可以偶聯(lián)細(xì)胞興奮性和能量代謝的受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控的、具有弱內(nèi)向整流作用的一類重要分子。文獻(xiàn)報(bào)道,KATP通道在大腦各區(qū)幾

4、乎均有表達(dá),在神經(jīng)血管單元的三種主要細(xì)胞神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上也有分布表達(dá)。研究顯示,該通道在生理?xiàng)l件下往往處于關(guān)閉狀態(tài),而在缺血/缺氧狀態(tài)下開放,通過減少興奮性遞質(zhì)的釋放以及啟動(dòng)下游多條細(xì)胞信號(hào)通路,可在多種組織中發(fā)揮抗缺血/缺氧損傷的內(nèi)源性保護(hù)作用。
　　埃他卡林是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類新藥,具有脂肪胺結(jié)構(gòu)的新結(jié)構(gòu)類型的KATP通道開放劑,在國(guó)際上被列為第九類鉀通道開放劑。他是小分子化合物能夠透過血腦屏障。前期研究發(fā)

5、現(xiàn)在沙土鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型上發(fā)現(xiàn)埃他卡林對(duì)缺血所致動(dòng)物行為異常具有明顯的對(duì)抗作用,能夠減少興奮性遞質(zhì)的釋放;能夠劑量依賴性地減少全腦缺血所致海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的丟失。在腦卒中易感型自發(fā)性高血壓大鼠鹽負(fù)荷模型上發(fā)現(xiàn),埃他卡林劑量依賴性地減少腦卒中的發(fā)生率和致死率,延緩卒中發(fā)生并延長(zhǎng)存活時(shí)間;在減壓缺氧大鼠腦損傷模型上發(fā)現(xiàn),埃他卡林對(duì)高原腦水腫具有防治作用,能夠維持血腦屏障的通透性,維持腦內(nèi)離子平衡。但是埃他卡林作為ATP敏感

6、性鉀通道開放劑在缺氧腦損傷的模型上是否可以靶向神經(jīng)血管單元發(fā)揮保護(hù)作用以及埃他卡林是如何針對(duì)缺氧腦損傷靶向于缺氧腦損傷進(jìn)程中神經(jīng)血管單元的功能的動(dòng)態(tài)變化及其相互調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用的,即埃他卡林實(shí)現(xiàn)神經(jīng)血管保護(hù)作用的分子作用機(jī)制尚未闡明。進(jìn)一步明確埃他卡林對(duì)缺氧性腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制將為埃他卡林靶向神經(jīng)血管單元發(fā)展成為針對(duì)神經(jīng)損傷多元復(fù)雜病理機(jī)制諸多關(guān)鍵環(huán)節(jié)和高度激活的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的多潛能神經(jīng)保護(hù)劑提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ),也將為

7、缺氧腦損傷的預(yù)防和治療帶來新的治療策略。
　　本研究從不同的層次來研究埃他卡林對(duì)缺氧損傷神經(jīng)血管單元的多環(huán)節(jié)多途徑保護(hù)作用。在整體動(dòng)物水平上,采用10%氧濃度常壓缺氧艙,并結(jié)扎大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈造成缺氧腦損傷模型,證明埃他卡林對(duì)大鼠缺氧腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。在細(xì)胞水平上,建立連二亞硫酸鈉無糖環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)胞糖氧剝奪缺氧損傷模型,通過神經(jīng)血管單元(NVU)成員細(xì)胞神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn),證實(shí)埃他卡林具有抗缺氧損傷NVU細(xì)

8、胞的保護(hù)作用。此外,本研究進(jìn)一步探究埃他卡林激活KATP通道靶向神經(jīng)血管單元抗缺氧腦損傷涉及的分子機(jī)制。
　　研究得到了如下的結(jié)果:
　　第一部分：埃他卡林對(duì)腦神經(jīng)血管單元缺氧損傷的保護(hù)作用
　　一、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元主要細(xì)胞類型的保護(hù)作用
　　1、神經(jīng)血管單元細(xì)胞表達(dá)KATP亞型的差異
　　RT-PCR結(jié)果顯示,在NVU三種細(xì)胞中Kir6.1的mRNA表達(dá)不同,微血管內(nèi)皮細(xì)胞﹤神經(jīng)元﹤星形膠質(zhì)細(xì)胞;S

9、UR2B的mRNA表達(dá)也有差異,神經(jīng)元﹤星形膠質(zhì)細(xì)胞﹤微血管內(nèi)皮細(xì)胞;在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Kir6.1和Sur2B的表達(dá)比較也存在顯著差異,Kir6.1﹤SUR2B。
　　2、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元缺氧損傷細(xì)胞存活率的影響
　　在體外細(xì)胞缺氧損傷模型下,給予0.01,0.1,到1μmmol/l的埃他卡林可以明顯地提高NVU細(xì)胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷后的存活率。
　　3、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元缺

10、氧損傷細(xì)胞LDH的釋放的影響
　　0.01,0.1,和1μmmol/l的埃他卡林后可以顯著的降低NVU成員細(xì)胞在低氧損傷下LDH的釋放量。埃他卡林的這種作用可以被KATP的阻斷劑格列苯脲所阻斷。
　　二、埃他卡林對(duì)大鼠缺血缺氧腦損傷的保護(hù)作用
　　1、埃他卡林對(duì)大鼠缺血缺氧腦損傷病理改變的影響
　　利用大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并處于10%常壓缺氧環(huán)境造成,大鼠缺氧腦損傷模型,用HE染色的方法觀察大鼠腦組織的病理變化,

11、結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞間隙明顯增大,血管周圍間隙增大,神經(jīng)元數(shù)量減少,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹增大,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。不同劑量的埃他卡林給藥組(2,4,8mg/kg,每天灌胃給予)仍可見少量的膠質(zhì)細(xì)胞和血管周圍空暈,隨著劑量增大,腦組織損傷程度逐漸減輕。
　　2、埃他卡林對(duì)大鼠缺血缺氧腦損傷血腦屏障通透性變化的影響
　　通過透射電鏡觀察大鼠缺血缺氧腦損傷后血腦屏障的結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn),正常情況下,可見血管外周間隙致密;缺血缺氧組

12、大鼠血管和組織外周間隙增大,可見明顯的間隙和空泡;不同劑量埃他卡林(2,4,8kg/mg,每天灌胃給予)組作用之后可見血管外周間歇有不同程度的減小。
　　第二部分：埃他卡林對(duì)腦神經(jīng)血管單元缺氧損傷保護(hù)作用分子機(jī)制的研究
　　一、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元缺氧損傷凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　1、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元缺氧損傷細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響
　　Hoechest33258染色發(fā)現(xiàn),神經(jīng)血管單元細(xì)胞在缺氧損傷的環(huán)境中

13、,體現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)密度增加,濃縮集聚等典型的凋亡特征,而給予埃他卡林后,凋亡細(xì)胞數(shù)量下降,染色質(zhì)濃縮程度減輕。
　　2、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元缺氧損傷細(xì)胞凋亡率的影響
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率,在缺氧條件下,較之正常組,凋亡率顯著增高(P﹤0.05),三種細(xì)胞皆有類似的結(jié)果。給予0.01,0.1和1μmmol/l埃他卡林后,凋亡率顯著降低。
　　3、埃他卡林對(duì)缺氧損傷神經(jīng)血管單元細(xì)胞抗凋

14、亡作用強(qiáng)弱比較
　　埃他卡林對(duì)神經(jīng)元的抗凋亡作用與它對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡作用存在顯著差異,(P﹤0.025)。埃他卡林對(duì)抗缺氧損傷引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡作用與它對(duì)內(nèi)皮的抗凋亡作用也明顯差異,(P﹤0.017)。
　　4、埃他卡林對(duì)神經(jīng)血管單元缺氧損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的影響
　　缺氧損傷之后,神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中caspase-3mRNA和蛋白在模型組較之正常組均明顯增高,0.01到1μmmol/l埃他卡林給

15、藥組中caspase-3mRNA和蛋白表達(dá)較之模型組都發(fā)生顯著下調(diào)。0.01到1μmmol/l的埃他卡林處理細(xì)胞之后,NVU三種成員細(xì)胞中bax的mRNA表達(dá)較之模型組顯著下降,而bcl-2的mRNA表達(dá)則明顯升高。模型組細(xì)胞中caspase-9的蛋白表達(dá)明顯升高,與正常組有顯著差異,P﹤0.05。而埃他卡林作用組中caspase-9的蛋白表達(dá)顯著下降。NVU細(xì)胞缺氧損傷后,Westernblot的方法檢查細(xì)胞胞漿中的cytC的蛋白表達(dá)

16、較之正常對(duì)照明顯增加,而1mmol/l的埃他卡林可以逆轉(zhuǎn)cytC的表達(dá)上調(diào)。此外,Westernblot的方法還證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中pAkt/tAkt的蛋白表達(dá)在缺氧損傷后顯著下調(diào),而埃他卡林可以明顯的上調(diào)pAkt/tAkt的蛋白表達(dá)。
　　5、埃他卡林調(diào)節(jié)大鼠缺氧腦損傷腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況
　　大鼠缺氧腦損傷后,利用IHC的方法發(fā)現(xiàn)腦組織中Bcl-2的表達(dá)減少,同時(shí)Bax的表達(dá)增加,致Bcl-2/Bax

17、的比值減小。當(dāng)灌胃給予8mg/kg埃他卡林后,可以抑制腦缺血再灌注損傷所致的腦細(xì)胞凋亡,表明它具有神經(jīng)保護(hù)作用。這一作用與其逆轉(zhuǎn)Bcl-2表達(dá)下調(diào),逆轉(zhuǎn)Bax的表達(dá)上調(diào)以及對(duì)抗Caspase-3的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在正常大鼠腦皮層中作為維持血腦屏障的成員之一的MMP-9呈現(xiàn)致密分布。大鼠發(fā)生缺氧腦損傷后,腦皮層組織中MMP-9的表達(dá)下降,血腦屏障通透性增加;8mg/kg的埃他卡林組大鼠腦皮層MMP-9的表達(dá)顯著上升。

18、正常大鼠腦組織中有一定量的pCREB表達(dá),大鼠缺氧缺血腦損傷后pCREB的表達(dá)明顯少于正常組,而給予埃他卡林的大鼠,腦組織中可見pCREB的表達(dá)較之模型組顯著上升。pCREB可促進(jìn)下游促神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放和細(xì)胞存活。
　　二、埃他卡林對(duì)大鼠缺氧腦損傷線粒體功能的影響
　　1、埃他卡林對(duì)大鼠缺氧腦損傷腦線粒體形態(tài)的影響
　　缺氧缺氧損傷組大鼠腦線粒體,單位面積內(nèi)數(shù)量下降,HE染色結(jié)果可見大部分線粒體膜出現(xiàn)破損的狀態(tài),線粒

19、體嵴間隙變大,出現(xiàn)空泡。缺氧損傷后給予埃他卡林2mg/kg,線粒體數(shù)量有所增加,線粒體膜破損減輕,嵴間隙變小。
　　2、埃他卡林對(duì)大鼠缺氧腦損傷腦線粒體功能的影響
　　大鼠缺氧腦損傷后,利用氧電極檢查腦線粒體的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn),缺氧損傷組的ATP合成速率下降至(117.32±1.72),較之正常對(duì)照組(128.82±9.68),下降明顯,P﹤0.05。而埃他卡林能增加大鼠缺氧腦損傷腦線粒體ATP合成速率達(dá)到(128.43±1

20、.12);埃他卡林能增加大鼠缺氧腦損傷腦線粒體磷/氧比即P/O比值(2.11±0.05)較之缺氧損傷組(2.08±0.04),有顯著差異;埃他卡林能增強(qiáng)大鼠缺氧腦損傷腦線粒體的呼吸率(respiratory controlrate,RCR)為(3.11±0.24),較之缺氧損傷組(2.91±0.23)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可見埃他卡林可以維持缺氧損傷線粒體后的形態(tài)和功能。
　　3、埃他卡林對(duì)缺氧損傷神經(jīng)血管單元細(xì)胞線粒體膜電位的影響

21、>　　經(jīng)過缺氧損傷后NVU細(xì)胞經(jīng)羅丹明123染色,發(fā)現(xiàn)羅丹明123的熒光強(qiáng)度都明顯下降,說明線粒體膜電位明顯下降。而埃他卡林預(yù)處理過的細(xì)胞經(jīng)缺氧損傷之后,線粒體膜電位的下降得到一定程度的逆轉(zhuǎn)。
　　4、埃他卡林對(duì)維持神經(jīng)血管單元細(xì)胞膜電位作用差異比較
　　埃他卡林對(duì)神經(jīng)元線粒體膜電位的維持作用和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用存在顯著區(qū)別。
　　5、埃他卡林對(duì)缺氧損傷神經(jīng)血管單元ROS生成的影響
　　采用DCFH-DA探針測(cè)定細(xì)