在體硅膠室在胰島移植中的應用研究.pdf

1、背景:
　　胰島細胞移植不僅可以改善1型糖尿病患者的血糖控制,避免強化胰島素治療導致的低血糖昏迷,而且能阻止甚至逆轉糖尿病并發(fā)癥。臨床上胰島移植90％經門靜脈移植到肝臟,但是移植過程中細胞丟失嚴重,胰島在肝臟不能長期存活以及移植后容易發(fā)生立即經血液介導的炎癥反應,所以研究者希望能找到更合適胰島移植的部位。天然移植部位包括肺、肝、脾臟的血管內,胰腺、皮下、肌肉、骨、腎包膜、網(wǎng)膜囊等組織和器官內,免疫豁免區(qū)如大腦、胸腺、睪丸等已被探索

2、是否可以作為胰島移植部位。但是這些天然的移植部位若應用于臨床時均存在很多不足,相比之下,利用人工裝置構建胰島移植部位顯現(xiàn)出良好的臨床應用前景。我們實驗室在前期的研究中構建了一種在體硅膠室。這種由硅膠材料制作、中空、表面帶孔的室性裝置植入皮下后,組織液可通過室表面的孔聚集在室內。對室內組織液的成分進行分析后發(fā)現(xiàn)其中含有多種生長因子,并且這些組織液能夠在體外支持多種細胞的存活及分裂增殖。此外將軟骨細胞/支架材料復合物放入在體硅膠室后,能構建

3、出組織工程軟骨。這些研究結果表明,這樣一種室性裝置不僅能在體構建出一定的物理空間供細胞移植,而且室內聚集的組織液能夠維持細胞存活。因此我們認為這種在體室性裝置有望作為內分泌細胞的移植部位,尤其是對于主要受局部微環(huán)境中葡萄糖調控的胰島細胞。
　　目標:
　　⑴建立分離和純化小鼠胰島的標準化方法;
　?、铺接懡M織液體外培養(yǎng)胰島細胞時是否可以維持其活力及功能;
　?、翘剿髟隗w硅膠室作為胰島移植部位的可行性;
　　

4、⑷觀察在體硅膠室內移植胰島對糖尿病小鼠血糖的調控。
　　方法:
　?、乓葝u獲取:采用在體膽總管灌注膠原酶P(1.3U/ml)方法,分離 C57BL/6J小鼠胰島,Histopaque1077密度梯度離心及手檢胰島兩步法純化胰島。
　?、俨捎肈TZ染色法鑒定胰島,計算每只胰腺的產出。
　　②葡萄糖刺激胰島素分泌實驗,計算葡萄糖刺激指數(shù),評估胰島的內分泌功能。
　　⑵體外實驗:①將硅膠室植入小鼠背部,定期收集室

5、內組織液備用。
　?、谛∈笠葝u細胞培養(yǎng):分別用含5.5mM和11mM葡萄糖濃度的組織液與 RPMI1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清)體外培養(yǎng)胰島細胞2周,AO-PI染色鑒定胰島細胞活性,葡萄糖刺激胰島素分泌實驗評估胰島細胞功能。
　　⑶可行性研究:①硅膠室內組織液糖與血糖關系的研究:腹腔注射葡萄糖,分別在0、15、30、60、90、120min檢測血糖及室內組織液中葡萄糖水平并做分析。
　?、谑覂纫葝u素調控血糖的研究:研

6、究不同給藥途徑(硅膠室內、皮下、腹腔內)下血糖的變化。
　?、润w內研究:①采用鏈脲佐菌素按200g/kg體重單次腹腔注射誘導1型糖尿病小鼠模型。
　?、谝葝u細胞移植2周前于小鼠背部植入硅膠室。
　　③實驗分組:正常對照組(正常小鼠植入或不植入硅膠室),糖尿病對照組(糖尿病小鼠植入或不植入硅膠室),硅膠室內胰島移植組及及腎包膜下胰島移植組。
　?、芤浦埠笄?周測隨機血糖,移植第5周行腹腔葡萄糖耐量試驗,之后取材做H

7、E染色及免疫組化染色。
　?、山y(tǒng)計方法:用統(tǒng)計軟件Prism5.0進行統(tǒng)計分析,計算各組的均數(shù)和標準誤,完全隨機設計的實驗采用One-way ANOVA與Tukey’s檢驗進行多組間的相互比較,隨機區(qū)組設計的實驗采用隨機區(qū)組設計資料的方差分析,曲線下面積由統(tǒng)計軟件按梯形規(guī)則計算得到。認為P<0.05有統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　?、懦晒Ψ蛛x純化胰島細胞:
　　①經密度梯度離心及手檢胰島兩步法純化得到的胰島細胞純度

8、較高。
　?、诿恐灰认倨骄a出胰島細胞約145±27.5個。
　?、鄯蛛x的胰島細胞葡萄糖刺激指數(shù)SI為4.04±0.9。
　?、平M織液能在體外維持胰島細胞的存活及功能:
　　①小鼠在體硅膠室內組織液色淡黃、呈清亮狀,組織液中葡萄糖濃度為5.5mM。
　?、谝葝u細胞體外培養(yǎng)2周時,組織液培養(yǎng)組中胰島細胞外緣細胞突起較少,而RPMI1640培養(yǎng)組中細胞向外伸展形成較大的觸角。
　?、劢M織液組(5.5mM)

9、、組織液組(11 mM)、RPMI1640培養(yǎng)組(11 Mm)、RPMI1640培養(yǎng)組(5.5mM)活細胞率分別為91%、84%、76%和63%。
　?、芨鹘M的葡萄糖刺激指數(shù)(SI)分別為3.81±0.72,2.72±0.63,2.63±0.81,1.33±0.79。組織液體外培養(yǎng)胰島細胞時,細胞的形態(tài)、活力及功能均好于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液;而且含5.5mM葡萄糖的組織液優(yōu)于含11mM葡萄糖的組織液,但是含11

10、mM葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液優(yōu)于含5.5mM葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液。
　?、窃隗w硅膠室內組織液中葡萄糖的變化能反應血糖的變化,只是血糖在短時間內劇烈升高時,組織液中葡萄糖升高時間上相對滯后于血糖;室內胰島素可以調控全身血糖。
　?、賁TZ誘導糖尿病小鼠造模成功率為81%。
　?、谔秦摵汕?血糖與硅膠室中組織液中葡萄糖濃度分別為3.9±1.3 mmol/L和3.0±1.1mmol/L,兩者無統(tǒng)計學差異(P>

11、0.05)。糖負荷15min時,血糖在這一時間內快速上升至17.2±2.3 mmol/L,而硅膠室內組織液中葡萄糖濃度為7.8±1.9 mmol/L,兩者有統(tǒng)計學差異(P<0.05),糖負荷30min時,兩者均達到峰值。之后,血糖與室內組織液中葡萄糖濃度緩慢下降,在各時間點均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　?、墼隗w硅膠室內胰島素在降血糖的時間和效應方面,與皮下注射、腹腔注射沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　⑷在體硅膠室

12、內移植胰島后可逆轉糖尿病小鼠高血糖:
　　①胰島素、胰高血糖素免疫組化染色證實硅膠室內及腎包膜下移植胰島細胞形態(tài)及功能維持良好。
　?、陔S機血糖檢測結果顯示胰島細胞移植到在體硅膠內可逆轉糖尿病小鼠高血糖。
　　③IPGTT中,硅膠室內胰島移植組血糖變化趨勢與腎包膜下胰島移植組及正常對照組基本一致。
　　④糖負荷0-15min,硅膠室內胰島移植組血漿中胰島素總量低于腎包膜下胰島移植組及植入硅膠室的正常對照組,有統(tǒng)計

13、學差異(P<0.05)。硅膠室胰島移植組胰島素 AUC0-15和AUC15-30分別低于腎包膜下胰島移植組38%和15%,但兩組胰島素AUC30-60和AUC0-120沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　?、萏秦摵?5min時,血中葡萄糖濃度高于硅膠室內組織液中的葡萄糖濃度,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。之后各時間點,組織液中葡萄糖濃度與血糖濃度無統(tǒng)計學差異(P>0.05);糖負荷30min時,胰島移植組室內組織液中葡萄糖濃度達峰

14、值,胰島素濃度也達峰值。此時,胰島移植組室內組織液中葡萄糖濃度與植入硅膠室的糖尿病對照組相比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而胰島素遠遠高于對照組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　結論:
　?、判∈笠葝u細胞的分離和純化過程復雜,操作中需注意每個細節(jié)。
　?、票狙芯渴状斡媒M織液體外培養(yǎng)胰島細胞,證實這種培養(yǎng)液比最常用的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液(葡萄糖11mM)更利于維持細胞存活及功能,且組織液作為天然的

15、細胞賴以生存的環(huán)境,用組織液體外培養(yǎng)胰島細胞能更好的研究胰島細胞生理病理的變化。
　?、潜狙芯渴状螌@種擴散型裝置內組織液中葡萄糖與血糖的關系進行研究,發(fā)現(xiàn)硅膠室內組織液中葡萄糖的變化能反應血糖的變化,只是在血糖短時間內劇烈升高時,組織液中葡萄糖升高時間上相對滯后于血糖;而室內胰島素通過特定途徑可以調控全身血糖。
　　⑷本研究得出血管化的胰島與依靠營養(yǎng)物質擴散存活的胰島在調控糖代謝方面的差異,血管化的胰島能及時的對血糖升高做