減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207asd基因突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性.pdf

1、鼠傷寒沙門氏菌(St)是一種腸道致病菌，它是一種胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌。利用侵襲性胞內(nèi)細(xì)菌作為載體傳遞外源抗原基因疫苗是目前基因免疫研究的熱點(diǎn)之一[67]。它可將質(zhì)粒DNA直接呈遞給抗原提呈細(xì)胞(APC)，攜帶質(zhì)粒DNA的細(xì)菌在APC細(xì)胞內(nèi)發(fā)生溶解或以宿主吞噬小體為橋梁進(jìn)入胞質(zhì)，并將DNA釋放到細(xì)胞核，使抗原基因在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)而誘導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。通過各種方法減毒的沙門氏菌，雖然失去了對動物的致病性，但不影響其在體內(nèi)的繁殖和侵襲能

2、力。SL7207是其中的一種，它是由一個基因，即aroA基因的突變構(gòu)建的減毒株。SL7207因其aroA基因的突變，自身不能合成需要的芳香族氨基酸，必須從外界獲取芳香族氨基酸才能生長，而哺乳動物體內(nèi)不含有該類氨基酸，使得SL7207在哺乳動物體內(nèi)生長受限，從而達(dá)到了減毒的目的。 減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207是DNA疫苗常用的載體工程菌，asd(asparticsemialdehydedehydrogenase)基因所編碼的天冬

3、氨酸半醛脫氫酶，是細(xì)菌賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸(diaminopimelicacid，DAP)合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要成分。當(dāng)asd基因發(fā)生突變時，細(xì)菌不能自行合成DAP，菌體就融解死亡，所以其生長依賴DAP的外部加入。本研究通過同源重組的方式，構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌SL7207asd基因突變株SL7207(asd-)，并通過比較SL7207與SL7207(asd-)在體內(nèi)、體外的生長、增殖情況

4、，對SL7207(asd-)的部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究。 1減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207asd基因突變株的構(gòu)建與鑒定為構(gòu)建asd基因突變株，首先采用PCR的方式，從減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207的染色體上擴(kuò)增了asd基因上游561bp序列，其中包括asd基因5’端的61bp的上游序列，asd基因下游的837bp序列，其中包括337bp的asd基因3’端序列。將這兩個片段連接后，以連接產(chǎn)物作為模板，PCR擴(kuò)增出asd基因缺失的同源

5、核苷酸片段，將這個片段克隆到pMDl8-T載體上，對這個片段進(jìn)行核苷酸序列的測定，然后將這個片段從pMDl8-T載體上用BamHI限制性內(nèi)切酶切下，把這個片段克隆到自殺質(zhì)粒pGMBl5l上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞SPY372λpir，利用抗性固體培養(yǎng)基篩選正確連接的陽性菌株，擴(kuò)增該質(zhì)粒，將這個質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)SL7207中進(jìn)行同源重組，采用PCR方式觀察重組現(xiàn)象，篩選穩(wěn)定的突變株。本研究通過上述方式篩選到了一株asd基因缺失的SL7207菌株，但是

6、，它在沒有添加DAP的普通LB培養(yǎng)基上也可以生長，其生物學(xué)特性與SL7207原株有很大的不同。 2減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207asd基因突變株SL7207(asd-)的生物學(xué)特性利用同源重組獲得的鼠傷寒沙門氏菌SL7207asd基因突變株SL7207(asd-)，在生物學(xué)特性上與原始鼠傷寒沙門氏菌SL7207菌株有很大的不同，在普通LB培養(yǎng)基中，生長速度明顯減慢；在普通LB中添加了DAP和賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸后SL7207(

7、asd-)生長速度接近普通SL7207。該突變株在MDCK上皮細(xì)胞中的侵襲和增殖能力很弱，在RAW264.7巨噬細(xì)胞中，初期的侵襲力與普通SL7207接近，但在巨噬細(xì)胞中的生存和增殖能力明顯減弱。小鼠口服接種感染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SL7207(asd-)在ICR小鼠體內(nèi)生存能力比SL7207下降許多(P＜0.05)，對肝臟和脾臟的侵襲力也下降許多。同時，被機(jī)體清除的時間縮短，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體應(yīng)答水平顯著低于SL7207(P＜0.05)。