轉(zhuǎn)化生長因子β1作用下絨癌JEG-3細(xì)胞c-mycTβRⅠ, TβRⅡmRNA表達(dá).pdf

1、絨毛膜癌(choriocarcinoma CC)簡稱絨癌,是一種繼發(fā)于正?；虍惓Ｈ焉镏蟮淖甜B(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestational trophoblastic tumor,GTT)。絨癌分為妊娠性絨癌(gestational choriocarcinoma,GC)和非妊娠性絨癌（non-gestational choriocarcinoma,NGC)兩種。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor beta1,T

2、GF-β1)是一種多功能多肽類細(xì)胞因子,因其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成,參與胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)等,成為目前研究最多的參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵入調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子。其 I型受體(TβR-I)和II型受體(TβRII)是跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶,TGF-β1與 TβR-I/ TβRII結(jié)合后,使得下游 Smads蛋白磷酸化,繼而啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。其中,TGF-β1、TβR或 Smad

3、s任一環(huán)節(jié)元件異常,都可以引起TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)紊亂。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)的主要信息傳遞系統(tǒng),在人類已鑒定出四條 MAPK通路,其中,p38MAPK通路在細(xì)胞惡變和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。參與了調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。有些學(xué)者研究了在皮膚光老化的治療中以及 TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的纖維化過程中

4、 Smad2/3與 p38MAPK的相互作用,揭示了在多種疾病的發(fā)生機(jī)制中兩條信號通路間的串話現(xiàn)象。c-myc基因是一種原癌基因,與細(xì)胞周期關(guān)系密切,一旦被激活,可通過對細(xì)胞的增殖作用,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。c-myc癌基因基因定位于染色體8q24,全長6-7kb,含3個外顯子,編碼蛋白由49個氨基酸殘基組成,分子量達(dá)64/67kd。c-myc是細(xì)胞內(nèi)多種信號通絡(luò)下游的靶基因,c-myc蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡方面發(fā)

5、揮重要作用,它的過度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[7],因此,我們用 MTT法觀察了5ng/ml TGF-β1在不同作用時間下對絨癌 JEG-3細(xì)胞的增殖的影響,尋找一個合適的不引起細(xì)胞增殖的時間點,用不同濃度的TGF受體Ⅰ、II抑制劑（LY364947)和p38MAPK抑制劑(SB203580)作用JEG-3細(xì)胞,并通過qRT-PCR法檢測JEG-3細(xì)胞中c-myc及TβRⅠ、TβR II mRNA的差異表達(dá),以期進(jìn)一步揭示絨癌的生物學(xué)轉(zhuǎn)

6、化機(jī)制。
　　目的:通過qRT-PCR法檢測JEG-3細(xì)胞中c-myc及TβRⅠ,TβR II mRNA的表達(dá)差異,以期探討絨癌中 TGF-β1介導(dǎo)的Smads與 p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相互作用,從而更深一步地揭示絨癌的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法:體外常規(guī)培養(yǎng)絨毛膜癌 JEG-3細(xì)胞系,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％融合度后,用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,制備成單細(xì)胞懸液。①將 JEG-3細(xì)胞按初始

7、濃度為3×104個細(xì)胞/mL接種于96孔板,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達(dá)60%融合度后,將培養(yǎng)基改為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)12小時,以確保細(xì)胞的同步化。用5ng/mlTGF-β1作用于細(xì)胞,分別于1h、2h、6h、12h、24h終止培養(yǎng)。同期設(shè)立不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白組和只有細(xì)胞沒有 TGF-β1作用的對照組。除去培養(yǎng)基,加入20μL5mg/mlMTT與180μL RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃、5% CO

8、2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。,除去培養(yǎng)基并向每孔中加入150μl二甲基亞砜溶液?；靹蚝?在室溫溫度孵育10分鐘后,在酶標(biāo)儀490nm波長處檢測各孔的OD值。每組細(xì)胞設(shè)立四個平行孔。
　　將 JEG-3細(xì)胞按初始濃度為5104個細(xì)胞/ ml接種于6孔板中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達(dá)60%融合度后,分別加入1μM SB203580,3μM SB203580,1μM LY364947,3μM LY364947作用2h后,各組加入5

9、ng/mlTGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)0.5h。同時設(shè)立只加細(xì)胞的對照組和不加 SB203580和LY364947,只加 TGF-β1的TGF-β1組。終止培養(yǎng)后,各組細(xì)胞提取總 mRNA,用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)分別檢測c-myc、TβRⅠ、TβRIImRNA的表達(dá)水平,同時,選取β-actin作為內(nèi)對照

10、。
　　結(jié)果:
　　(1)采用5ng/ml的TGF-β1刺激JEG-3細(xì)胞,觀察其對細(xì)胞增殖和周期的影響,篩選不引起細(xì)胞增殖的TGF-β1作用時間
　　以5ng/mlTGF-β1干預(yù) JEG-3細(xì)胞,MTT法測定不同時間 JEG-3細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示:TGF-β1作用1h、2h時,與對照組相比 JEG-3細(xì)胞沒有顯著增殖(P>0.05)。這表明,在2h內(nèi),TGF-β1沒有促進(jìn)絨毛膜癌的增殖。TGF-β1作用6h時

11、,JEG-3細(xì)胞顯著增殖(P<0.05)。隨后,隨著時間的延長,當(dāng) TGF-β1作用時間為12h、24h時,JEG-3細(xì)胞的增殖反而逐漸下降。因此,我們確定后續(xù)實驗選用 TGF-β1作用時間為2h。
　　(2) qRT-PCR檢測不同組別JEG-3細(xì)胞c-myc mRNA表達(dá)情況
　　在 TGF-β1作用下,c-myc的mRNA表達(dá)上調(diào),比正常對照組明顯升高,差異均具有顯著性(P<0.05)。給予SB203580和LY364

12、947這兩種抑制劑后,c-myc的mRNA表達(dá)均降低,與 TGF-β1干預(yù)組比較明顯下降,且抑制作用與濃度呈正相關(guān)。
　　(3) qRT-PCR檢測不同組別JEG-3細(xì)胞TβRⅠ,TβRII的mRNA表達(dá)情況
　　在 TGF-β1作用下,TβRⅠ,TβRII的mRNA表達(dá)上調(diào),比正常對照組明顯升高,差異均具有顯著性(P<0.05)。給予 SB203580和LY364947這兩種抑制劑后,TβRⅠ,TβRII的mRNA表達(dá)均降

13、低,且抑制作用與濃度呈正相關(guān)。TβRⅠ阻斷 TGF-β通路和p38MAPK通路可以降低TβRⅠ,TβRII的表達(dá)水平,并以劑量依賴性的方式抑制。
　　結(jié)論:
　　(1)TGF-β1能夠促進(jìn)JEG-3細(xì)胞中c-myc mRNA的表達(dá),阻斷TGF-β1/Smads和p38MAPK兩條通路后,能夠下調(diào) c-myc的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。
　　(2)阻斷TGF-β通路和p38MAPK通路可以降低TβRⅠ,TβRII的表達(dá)水