GST pi介導(dǎo)CML細(xì)胞的IFN-α抗性研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myelognous leukemia，CML)是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，干擾素-α(IFN-α)是治療CML的最有效制劑之一，但是干擾素耐藥比率也很高。本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用蛋白質(zhì)學(xué)方法分別比較分析發(fā)現(xiàn)IFN-α耐藥株KT-1/A3R．細(xì)胞高表達(dá)GST pi蛋白，然而IFN-α敏感株KT-1/A3細(xì)胞幾乎不表達(dá)此蛋白，運(yùn)用半定量RT-PCR和Western blotting也同樣證明上述

2、結(jié)論。先前研究還證明IFN-α誘導(dǎo)A3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡增加顯著，bcr/abl融合基因相應(yīng)表達(dá)下調(diào)；而抗性株細(xì)胞凋亡不明顯，bcr/abl融合基因表達(dá)下調(diào)也不明顯。以上研究表明GSTPl基因可能在A3R細(xì)胞對(duì)IF-α噸的耐受機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)應(yīng)用RNAi，抑制A3R細(xì)胞中GSTPl基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)IFN-α通過(guò)bcr/abl融合基因的作用而誘導(dǎo)的KT-1/A3R細(xì)胞凋亡，部分逆轉(zhuǎn)A3R細(xì)胞對(duì)IFN-α的耐藥性。

3、 目的初步探討GSTPl在腫瘤細(xì)胞增殖及抵抗細(xì)胞凋亡中的作用，為研究IFN-α對(duì)CML的耐藥機(jī)制提供新的思路。 方法1．選擇目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)GSTPl基因siRNA模板，構(gòu)建siRNA表達(dá)載體pSilencer-GSTP 1-A和pSilencer-GSTP1-B； 2．轉(zhuǎn)染針對(duì)GSTPl基因的兩對(duì)干擾質(zhì)粒，采用半定量RT-PCR和 Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證干擾的效果；3．A3R細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾

4、質(zhì)粒oSilencer-GSTPl-A及在IFN-α誘導(dǎo)下，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)48 h及72 h細(xì)胞凋亡率，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)24 h～96 h細(xì)胞數(shù)，MTT法測(cè)定24h～96 h細(xì)胞吸光度值，半定量RT-PCR測(cè)定48 h bcr/abl mRNA表達(dá)變化，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組與之相比較，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以上結(jié)果。 結(jié)果1．質(zhì)粒與脂質(zhì)體1：4(質(zhì)量/體積)比例混合轉(zhuǎn)染48 h，發(fā)現(xiàn)經(jīng)pSilencer-GSTPl-A干擾后

5、A3R，細(xì)胞中GSTPl基因表達(dá)下降約78﹪，蛋白表達(dá)下降約71﹪，經(jīng)pSilencer-GSTPl-B干擾后A3R細(xì)胞GSTPl基因表達(dá)下降約53﹪，蛋白表達(dá)下降約50﹪；2．經(jīng)oSilencer-GSTPl-A干擾后，與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組相比較，A3R細(xì)胞凋亡率48 h增加約4.53﹪，72 h增加約5.71﹪；臺(tái)盼藍(lán)拒染法：A3R細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率24 h～96 h分別約為4.56﹪、5.94﹪、5.83﹪、5.16﹪；MTT法：A3R細(xì)

6、胞生長(zhǎng)抑制率24 h～96 h分別約為4.48﹪、5.48﹪、6.06﹪、4.62﹪；RT-PCR測(cè)定48 h bcr/abl基因表達(dá)下調(diào)約26﹪。結(jié)論1．成功構(gòu)建了兩干擾質(zhì)粒pSilencer-GSTPl-A和pSilencer-GSTPl-B，而且質(zhì)粒干擾效果前者強(qiáng)于后者；2．A3R細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒pSilencer-GSTPl-A干擾后能顯著增強(qiáng)IFN-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)，但只能輕度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(P>0.05)；3.GST