龍血素A和龍血素B間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的研究.pdf

1、龍血素A（LA）和龍血素B（LB）均為龍血竭的活性成分，也是龍血竭藥物質(zhì)量的中藥參考成分。目前多是以高效液相色譜法（HPLC）檢測LA和LB的含量。雖然高效液相色譜法具有高靈敏度高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，但是高效液相色譜儀昂貴，實(shí)驗(yàn)的前處理步驟也特別繁雜，需要專業(yè)的操作人員，致使高效液相色譜法的使用和普及受限。酶聯(lián)免疫吸附測定方法（ELISA）與高效液相色譜法相比有著獨(dú)特的優(yōu)勢，ELISA方法簡單快速、高通量、高特異性、試劑便宜、使用安全、易于自

2、動(dòng)化操作，可以極大地提高檢測效率并降低檢測成本。建立檢測LA和LB的ELISA方法具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。
　　LA和LB是兩種結(jié)構(gòu)相似的小分子物質(zhì)，不具有免疫原性，要建立它們的酶聯(lián)免疫檢測方法，必須將它們分別與大分子結(jié)合形成人工抗原。先將 LA和LB的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，加上一個(gè)游離羧基，再分別與牛血清蛋白偶聯(lián)作為免疫原，與雞卵清蛋白偶聯(lián)作為包被原。用免疫原去免疫小鼠，刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，采用間接競爭 ELISA原理檢測樣品

3、中待測物的含量。主要步驟：使用相應(yīng)包被原包被酶標(biāo)板制成固相抗原，已包被的微孔中先后加入待測樣品溶液和抗血清進(jìn)行孵育，樣品中的抗原（LA或LB）與微孔表面固定的抗原（LA或LB）競爭結(jié)合抗血清中的多克隆抗體，洗滌除去未固定成分，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，IgG與固定的多克隆抗體結(jié)合，再次洗滌后加入可被HRP催化的顯色劑，經(jīng)硫酸終止反應(yīng)后的顯色程度與樣品中待測物的濃度呈負(fù)相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450/630nm雙波長下測定

4、其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的吸光度，計(jì)算出待測物的濃度。
　　實(shí)驗(yàn)得到的LA多克隆抗體和LB多克隆抗體，其效價(jià)分別達(dá)到8000和30000。LA和LB的間接競爭ELISA法對(duì)LA和LB的最低檢測限分別為3.9 ng/ml和26.1 ng/ml；批內(nèi)精密度分別為 CV≤10.7％和CV≤9.9%；批間精密度分別為CV≤11.5%和CV≤12.3%；回收率范圍分別為87.4～110.8%和109.8～113.5%；LA和LB的6種類