A型流感病毒NS1蛋白磷酸化研究.pdf

1、A型流感病毒(influenza virus A)屬于正粘病毒科，流感病毒屬;基因組為單股負(fù)鏈RNA，含有大小不同的8個(gè)獨(dú)立的RNA片段，其中非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructuralprotein1，NS1)由第8條RNA編碼的，相對(duì)分子量約為26 kDa，含有230-237aa。NS1在病毒粒子內(nèi)不存在，僅存在于病毒感染的細(xì)胞中。在WSN感染早期，NS1主要聚集在感染細(xì)胞的核內(nèi)，但在晚期主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。NS1主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域， N

2、-末端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)(RNA-binding domain，RBD)，主要與各類RNA結(jié)合;C-末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(effector domain)，參與同宿主細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)相互作用。NS1是一種多功能蛋白質(zhì)，通過與宿主蛋白的相互作用以實(shí)現(xiàn)病毒逃逸天然免疫功能，包括RIG-Ⅰ、Trim25、IKK、CPSF30、PABPⅡ、eIF4GI、PABPI和PKR等;以及NS1同病毒復(fù)制中間體RNA結(jié)合，阻斷宿主模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別病原

3、相關(guān)分子模式(PAMP)，通過與這些作用，NS1可以抑制宿主蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，以實(shí)現(xiàn)病毒的高效復(fù)制和感染。
　　病毒與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用的結(jié)果決定了病毒感染的進(jìn)程。一方面，宿主細(xì)胞受到病毒的感染后會(huì)很快啟動(dòng)一系列的抗病毒免疫反應(yīng)，抑制病毒的復(fù)制和病毒蛋白的合成;另一方面，病毒自身許多蛋白具有拮抗宿主細(xì)胞抗病毒免疫作用的功能，以利于病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和再感染。流感蛋白編碼的NS1就具有拮抗宿主細(xì)胞抗病毒作用的功能

4、，能與多種宿主因子發(fā)生相互作用，抵抗宿主的免疫防御作用。除對(duì)抗宿主免疫系統(tǒng)外，NS1蛋白還能促進(jìn)病毒自身的復(fù)制和翻譯效率。NS1蛋白與vRNP復(fù)合物中NP蛋白的相互作用促進(jìn)了病毒的復(fù)制;NS1蛋白通過與宿主eIF4GI的相互作用募集了翻譯起始因子到病毒的mRNA上，有效提高了病毒蛋白的翻譯水平。
　　本研究通過磷酸化質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)鑒定了WSN毒株NS1上的磷酸化位點(diǎn)，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行各種點(diǎn)突變置換，以確定其功能。在十二質(zhì)粒系統(tǒng)Ben8質(zhì)粒

5、（表達(dá)NS1蛋白）構(gòu)建各種點(diǎn)突變，然后進(jìn)行病毒拯救，發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)的點(diǎn)突變(T80E和S83D)所產(chǎn)生的病毒滴度和病毒生長曲線與WT相比存在一定差異。通過在PCMV-MYC載體上構(gòu)建各種點(diǎn)突變體，證明了在真核細(xì)胞水平，這些位點(diǎn)的點(diǎn)突變均沒有改變NS1蛋白的細(xì)胞定位。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)顯示突變體T80E和S83D對(duì)于IFN的抑制作用較NS1 WT有所減弱;通過NS1蛋白與poly(U)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)突變體T80E的NS1蛋白與