腺病毒介導的A20基因對耳蝸毛細胞保護作用的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的： 聽力損失作為名列第十五位的世界疾病，在發(fā)達國家，約有一億人遭受聽力損失，且90％為感音神經(jīng)性聾。據(jù)我國殘疾人抽樣調(diào)查統(tǒng)計，聽覺殘疾呈逐年上升態(tài)勢。毛細胞病變所導致的聽力喪失是耳聾的主要原因，因此如何保護毛細胞已成為科研工作者日益關注的課題。耳蝸毛細胞是將聲刺激轉化電化學能的末梢感受器，其中內(nèi)毛細胞是感受器細胞，負責將機械振動轉化為與之相連的聽神經(jīng)纖維的動作電位；外毛細胞與增強聽神經(jīng)的高度頻率選擇性、耳蝸自我的調(diào)

2、節(jié)功能有關。內(nèi)、外毛細胞的損傷都可引起不可逆的感音神經(jīng)性耳聾。耳蝸位于蝸殼內(nèi)，被其包裹和保護，同時存在血迷路屏障，這種獨特的生理結構導致耳蝸在解剖和功能上相對獨立，一旦受到損傷很難通過全身或局部循環(huán)與外界交流，主要靠自身代謝來排除損傷因素，因此如何提高毛細胞自身的保護功能，保護正常細胞不被進一步破壞是研究這一問題的關鍵。因此急切尋找一條途徑對毛細胞進行持久的保護。 機體遇到外界有害因子刺激時會產(chǎn)生防御性反射，而很多細胞在遇到有害

3、因素刺激時會產(chǎn)生一些保護性蛋白，鋅指蛋白A20就是其中之一。鋅指蛋白A20首先是在人的內(nèi)皮細胞中作為腫瘤壞死因子(TNF)刺激的應答產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)的。通過基因測序發(fā)現(xiàn)其可讀框編碼一個新型鋅指蛋白，命名為鋅指蛋白A20，簡稱A20。A20是一種存在于胞液的NF-κB(nuclearfactor-κB)活性負反饋調(diào)控蛋白，在許多細胞中都發(fā)現(xiàn)有A20的表達，A20mRNA中的3’端非翻譯區(qū)內(nèi)有4個規(guī)范重復序列ATTTA，正是該序列決定了A20在細

4、胞表達的不穩(wěn)定性。A20已在多種細胞如內(nèi)皮細胞、腦神經(jīng)細胞中顯示有抗炎、抗凋亡、壞死作用。研究表明，毛細胞的損傷會導致NF-κB和Caspase-3信號通路的改變，這一點和A20的抗損傷通路之間有共同交叉作用點，前者上調(diào)NF-κB和Caspase-3的表達，后者抑制NF-κB和Caspase-3的表達，因此A20可用于毛細胞的防護研究。A20在體內(nèi)的表達是快速而短暫的，因此需要體外構建載體來持續(xù)表達A20，從而發(fā)揮其抗損傷作用。腺病毒(

5、Ad)載體具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主細胞染色體等優(yōu)點，已被廣泛應用于內(nèi)耳基因治療研究。 造成毛細胞損傷有各種各樣的原因，其中藥物致耳毒性是日常生活中很常見的原因；同時現(xiàn)代社會、現(xiàn)代戰(zhàn)爭中電磁輻射尤其是高頻電磁輻射也是威脅人類健康的重要原因，因此本實驗選用這兩個損傷模型來進行研究。通過研究初步明確鋅指蛋白A20對內(nèi)耳毛細胞的保護作用及其分子機制，為改善和修復受損的聽功能提供了理論依據(jù)。 基于以上分析，本研究

6、首先建立了慶大霉素、高功率微波(HPM)致毛細胞損傷模型，觀察了A20在毛細胞正常、損傷條件下的表達規(guī)律，然后制備純化A20重組腺病毒表達載體pAdEasy-1/A20，觀察其在慶大霉素、HPM兩種損傷條件下對毛細胞的保護作用，并對其可能的機制進行了探討。 研究方法和結果： 1.HPM損傷毛細胞模型的建立：將豚鼠置于反射系數(shù)近似為零的微波暗室內(nèi)進行輻照，輻照劑量分別為30W/cm2、65W/cm2、90W/cm2，輻照時

7、間20min，輻照后3h、6h、12h三個時相點觀察。結果發(fā)現(xiàn)不同功率的輻照對豚鼠的神經(jīng)行為、體溫產(chǎn)生程度不一的影響，說明HPM可致豚鼠熱效應損傷；ABR閩值測定顯示功率65W/cm2輻照6h后出現(xiàn)顯著性差異；光鏡、電鏡觀察65W/cm26h后出現(xiàn)形態(tài)學改變，毛細胞損傷數(shù)目較輻照前有差異，尤其是內(nèi)毛細胞損傷較大，細胞間出現(xiàn)許多球形物質(zhì)。這部分實驗說明HPM可以造成毛細胞損傷，65W/cm26h可以作為損傷觀察的研究劑量。 2.慶

8、大霉素損傷毛細胞模型的建立：給予慶大霉素120mg/kg腹腔注射，連續(xù)10天，通過ABR、光鏡、電鏡觀察發(fā)現(xiàn)慶大霉素功能上可以造成聽力下降，形態(tài)上可以造成毛細胞損傷，其損傷主要表現(xiàn)為外毛細胞，第一排外毛細胞的損傷較第二、三排重。 3.鋅指蛋白A20在豚鼠耳蝸毛細胞的表達研究：通過耳蝸冰凍切片、A20原位雜交顯示正常情況下A20在體內(nèi)沉默表達，HPM、慶大霉素損傷后3h即出現(xiàn)表達，但6h后表達即減弱，12h后表達基本消失。說明體內(nèi)

9、毛細胞存在A20基因，其在損傷條件下出現(xiàn)短暫表達。 4.pAdEasy-1/20腺病毒的制備及其在體對毛細胞作用的表達：通過酶切連接的方式將pCAGGS-FLAGmA20質(zhì)粒的表達框連入pAdtrack-CMV穿梭載體，后者和Adeasy-1在大腸桿菌中進行同源重組，隨后轉染293細胞進行病毒顆粒包裝。經(jīng)單、雙酶切及PCR鑒定正確，大量擴增病毒后，通過GFP報告基因確定病毒滴度為5×10pfu/ml。 5.pAdEeay

10、-1/A20重組腺病毒對毛細胞的保護作用研究：通過耳蝸冰凍切片及免疫組化觀察，pAdEeay-1/A20可以成功感染毛細胞；我們把研究對象按毛細胞損傷模型分為慶大霉素和HPM兩個大組，每組又分為5個實驗組，分別為正常對照組、pAdEeay-1組、pAdEeay-1/慶大霉素注射(或HPM)組、pAdEeay-1/A20/慶大霉素注射(或HPM)組和人工外淋巴液/慶大霉素注射(或HPM)組。 結果發(fā)現(xiàn)正常對照組處死前后ABR聽閾無

11、明顯變化，P＞0.05；pAdEeay-1組耳蝸給藥前、后動物ABR反應閾變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明耳蝸給藥操作及重組腺病毒對動物ABR反應閾無明顯影響，未導致內(nèi)耳損傷；pAdEeay-1/慶大霉素(或HPM)組處死前后聽反應閾值變化明顯，P＜0.01，提示不含A20的pAdEeay-1未對慶大霉素(或HPM)造成的聽功能下降起到保護作用；pAdEeay-1/A20/慶大霉素(或HPM)組及人工外淋巴液/慶大霉素(或HPM)

12、組聽反應閾均提高，兩組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但pAdEeay-1/A20/慶大霉素(或HPM)組聽閾增高程度較人工外淋巴液/慶大霉素(或HPM)組低，兩者統(tǒng)計學比較有差異，兩組之間P＜0.05，提示A20能夠對慶大霉素(或HPM)所造成的聽功能下降起到一定的保護作用，但這種保護作用是不完全的。 毛細胞形態(tài)學觀察同樣發(fā)現(xiàn)pAdEeay-1/A20/慶大霉素(或HPM)組與正常對照組比較毛細胞損害數(shù)目有差

13、異(P＜0.05)，但同時pAdEeay-1/A20/慶大霉素組(或HPM)與pAdEeay-1/慶大霉素組(或HPM)、人工外淋巴液/慶大霉素(或HPM)組比較毛細胞損傷數(shù)目又有有明顯差異(P＜0.01)。說明A20可以在形態(tài)上對內(nèi)、外毛細胞起到一定的保護作用。 6.鋅指蛋白A20保護毛細胞的作用機制：理論上A20抗損傷和毛細胞的損傷通路上都有一個共同作用點就是caspase-3，但A20保護毛細胞是否是作用于caspase-

14、3這一通路還不得知，本研究采用免疫組化，通過對損傷組(慶大霉素、HPM)、pAdEeay-1/A20組比較發(fā)現(xiàn)免疫標記在正常對照組和空載體組中都呈陰性反應；損傷組和pAdEeay-1/A20組中冰凍切片標本均顯示有大量含棕黃色顆粒細胞出現(xiàn)在耳蝸Corti器內(nèi)，其中毛細胞和支持細胞均有陽性細胞出現(xiàn)，但pAdEeay-1/A20組的陽性顆粒細胞數(shù)明顯少于損傷組，損傷組與pAdEeay-1/A20組陽性細胞數(shù)經(jīng)IOD統(tǒng)計，結果具有顯著差異性，

15、P＜0.05。 結論： 1.本實驗成功制作電磁輻射(HPM)損傷毛細胞模型，發(fā)現(xiàn)HPM可以造成毛細胞損傷，HPM對毛細胞的損傷效應是隨劑量和時間的變化而變化的，同時發(fā)現(xiàn)HPM主要對內(nèi)毛細胞造成明顯的損傷，而且細胞間有不規(guī)則的球狀物出現(xiàn)。 2.鋅指蛋白A20在正常毛細胞中沉默表達，當受到外界損傷因素刺激后出現(xiàn)一過性表達，其表達時效僅數(shù)小時。 3.通過構建重組pAdEeay-1/A20腺病毒載體以及在毛細胞的