表沒(méi)食子兒茶毒沒(méi)食子酸酯(EGCG)改善脂毒性誘導(dǎo)的大鼠外周胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)生公認(rèn)的病理生理基礎(chǔ),但其具體機(jī)制尚未完全明了。目前2型糖尿病與肥胖緊密相關(guān)已經(jīng)成為一種共識(shí)。肥胖者由于體內(nèi)脂肪組織的過(guò)度積聚,導(dǎo)致釋放過(guò)多的游離脂肪酸(Free Fatty AcidFFA)。眾多證據(jù)表明,脂代謝紊亂在2型糖尿病發(fā)病中居于重要地位,FFA升高是2型糖尿病其發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,日益受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。近些年的研究表明,在2型糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展過(guò)程中,氧化應(yīng)激不僅關(guān)系到胰島素

2、抵抗(即影響胰島素的作用靶點(diǎn),如肝臟、脂肪和肌肉組織),而且直接影響胰島B細(xì)胞的功能,在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起了重要作用?？寡趸瘎┛蓽p少由基產(chǎn)生或直接滅活機(jī)體產(chǎn)生的自由基,并增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,從而阻止或延緩糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。因此,深入研究氧化應(yīng)激與糖尿病之間的相互關(guān)系,以及各種抗氧化劑的作用機(jī)制及效果,不但有助于了解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制,而且將為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供了一個(gè)新的策略。
　　 近幾年,茶葉的提取

3、物茶多酚因其安全無(wú)污染及強(qiáng)大的抗氧化作用日益受到大家的青睞。在茶多酚中,各組成份中以黃烷醇類(lèi)為主,黃烷醇類(lèi)又以?xún)翰杷?catechins)類(lèi)物質(zhì)為主,包括表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表茶素(EC)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)等,其中EGCG的含量最高,約占茶多酚總量的50％-70％。目前國(guó)內(nèi)外一些在細(xì)胞、動(dòng)物模型及人群流行病學(xué)方面的研究認(rèn)為EGCG可以改善胰島素抵抗及葡萄糖耐量,但其具體機(jī)制尚未清楚

4、。而對(duì)于EGCG對(duì)胰島β細(xì)胞功能影響方面的研究,目前的結(jié)論尚存在爭(zhēng)議。因此,本研究建立急性的游離脂肪酸升高引起胰島素抵抗的動(dòng)物模型,以排除慢性高脂的代償性反應(yīng),應(yīng)用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的評(píng)價(jià)胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)——高胰島素正血糖鉗夾試驗(yàn)評(píng)價(jià)靜脈應(yīng)用不同劑量EGCG對(duì)胰島素抵抗的改善情況,并探討其機(jī)制。同時(shí),初步探討其對(duì)高脂條件下Wistar雄性大鼠的胰島β細(xì)胞功能的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 (一)大鼠麻醉狀態(tài)下行頸動(dòng)靜

5、脈置管術(shù),術(shù)后恢復(fù)3天后清醒狀態(tài)下分別輸注生理鹽水、脂肪乳以及脂肪乳加不同劑量EGCG;
　　 (二)清醒狀態(tài)下行高胰島素正血糖鉗夾試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠胰島素敏感性;
　　 (三)采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖,放射免疫法測(cè)定胰島素和c肽;采用比色法測(cè)定血漿游離脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性,ELISA方法測(cè)定血漿中8-異前列腺素水平;
　　 (四)用Weste

6、rn-Blot方法檢測(cè)肌肉,脂肪組織中AMP-activatedproteinkinase(AMPK),phospho-AMPK(Thr172)及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中相關(guān)信號(hào)分子IRS-1,phospho-IRS-1(Ser307),Akt,phospho-Akt(Ser473)活性;
　　 (五)免疫組化方法檢測(cè)肌肉、脂肪組織GLUT-4;
　　 (六)用兩步法高糖鉗夾試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠胰島β細(xì)胞功能;
　　 (

7、七)免疫組化方法檢測(cè)胰腺組織胰島素的表達(dá);
　　 (八)胰腺組織勻漿MDA、SOD、GPx的檢測(cè);
　　 (九)Tunel方法檢測(cè)胰腺組織胰島β細(xì)胞凋亡情況;
　　 (十)Western-Blot方法檢測(cè)胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (一)在基礎(chǔ)狀態(tài),與生理鹽水輸注組(SAL)比較,脂肪乳輸注組(IH)組FFA增加了1倍(P＜0.01),血糖升高0.16倍(P

8、＜0.05),胰島素和C-肽分別增加了0.71倍、0.59倍(P＜0.05)。EGCG處理組與脂肪乳組相比,FFA水平無(wú)明顯變化,血糖水平輕度下降(P＜0.05),胰島素和C肽水平也分別明顯下降(P＜0.05);鉗夾組與鹽水組相比,FFA水平輕度下降(P＜0.01),胰島素水平大幅度升高(P＜0.01),C-肽明顯減少(低于所用試劑盒檢測(cè)下限);
　　 (二)在高胰島素正血糖鉗夾試驗(yàn)中,脂肪乳輸注組(IH)葡萄糖輸注率(GIR)

9、與生理鹽水組(SAL)相比下降了39％(P＜0.05),與脂肪乳輸注組相比,小劑量EGCG干預(yù)組(L-EGCG)GIR增加了56％,大劑量EGCG干預(yù)組(H-EGCG)GIR增加了72％,單獨(dú)EGCG干預(yù)組(EGCG)GIR與鹽水組(SAL)相比無(wú)明顯變化;
　　 (三)脂肪乳輸注增加了血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA(P＜0.01)和8-異前列腺素濃度(P＜0.01),減少了抗氧化酶SOD(P＜0.01)和GPx濃度(P＜0.01);

10、與脂肪乳組相比,2個(gè)劑量的EGCG干預(yù)組MDA(P＜0.05)和8-異前列腺素濃度(P＜0.05)均有所減少,SOD(P＜0.05)和GPx濃度(P＜0.05)都有所升高;
　　 (四)在肌肉組織中,脂肪乳組Thrl72位點(diǎn)磷酸化的AMPK明顯減少(P＜0.05),Ser307位點(diǎn)磷酸化的IRS-1活性增加(P＜0.05),Ser473位點(diǎn)磷酸化的Akt活性下降(P＜0.05),GLUT-4膜轉(zhuǎn)運(yùn)減少(P＜0.05),小劑量EG

11、CG干預(yù)組(L-EGCG)和大劑量EGCG干預(yù)組(H-EGCG)Thr172位點(diǎn)磷酸化的AMPK表達(dá)均明顯增多(P＜0.05),Ser307位點(diǎn)磷酸化的IRS-1活性下降(P＜0.05),Ser473位點(diǎn)磷酸化的Akt活性增加(P＜0.05),GLUT-4膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加(P＜0.05);
　　 (五)在脂肪組織中,脂肪乳組Thr172位點(diǎn)磷酸化的AMPK明顯減少(P＜0.05),Ser307位點(diǎn)磷酸化的IRS-1活性增加(P＜0.0

12、5),Ser473位點(diǎn)磷酸化的Akt活性下降(P＜0.05),GLUT-4膜轉(zhuǎn)運(yùn)減少(P＜0.05),大劑量EGCG干預(yù)組(H-EGCG)Thr172位點(diǎn)磷酸化的AMPK表達(dá)均明顯增多(P＜0.05),Ser307位點(diǎn)磷酸化的IRS-1活性下降(P＜0.05),Ser473位點(diǎn)磷酸化的Akt活性增加(P＜0.05),GLUT-4膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加(P＜0.05),單獨(dú)EGCC干預(yù)組與鹽水組相比,各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化(P＜0.05);
　　

13、 (六)在兩步高糖鉗夾試驗(yàn)中,脂肪乳輸注組大鼠在高糖刺激下的胰島素分泌曲線(xiàn)變鈍,胰島素變化率下降(P＜0.05),小劑量EGCG干預(yù)組(L-EGCG)和大劑量EGCG干預(yù)組(H-EGCG)葡萄糖刺激下的胰島素分泌率有不同程度的增加(P＜0.05);
　　 (七)脂肪乳48小時(shí)靜脈輸注增加了大鼠胰腺組織胰島細(xì)胞的凋亡(P＜0.05),而10mg/kg的EGCG干預(yù)組可以減少胰島β細(xì)胞的凋亡(P＜0.05);
　　 (八)脂

14、肪乳48小時(shí)靜脈輸注減少了胰腺組織抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),增加了促凋亡蛋白Bax的表達(dá),減少了Bcl-2/Bax(P＜0.05),而10mg/kg的EGCG干預(yù)組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增加,促凋亡蛋白Bax的表達(dá)減少,Bcl-2/Bax增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 給Wistar雄性大鼠靜脈輸注脂肪乳48小時(shí)使大鼠體內(nèi)FFA濃度升高了1倍左右,高胰島素正血糖鉗夾試驗(yàn)中脂肪乳組大鼠葡萄糖輸注率顯著下降

15、,說(shuō)明脂肪乳輸注誘導(dǎo)了大鼠的胰島素抵抗;
　　 靜脈給予5mg/kg和10 mg/kg EGCG干預(yù)明顯改善了大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài);脂肪乳輸注組大鼠血清中氧化損傷的指標(biāo)升高,抗氧化酶活性下降。機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗,給予EGCG干預(yù)后,氧化損傷的指標(biāo)下降,抗氧化酶活性升高,胰島素抵抗改善,說(shuō)明氧化應(yīng)激參與了脂毒性誘導(dǎo)的胰島素抵抗,而EGCG可以改善脂毒性誘導(dǎo)的胰島素抵抗;
　　 脂肪乳輸注組大鼠脂肪和肌肉組織中Thr172位

16、點(diǎn)磷酸化的AMPK活性下降,給予EGCG干預(yù)后Thr172位點(diǎn)磷酸化的AMPK活性恢復(fù),胰島素抵抗恢復(fù),說(shuō)明EGCG活化了AMPK途徑,并可能參與了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,改善了胰島素抵抗;
　　 脂肪乳輸注組大鼠脂肪和肌肉組織中經(jīng)典的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中Ser307位點(diǎn)磷酸化的IRS-1活性增加,Ser473位點(diǎn)磷酸化的Akt活性下降,GLUT-4膜轉(zhuǎn)運(yùn)減少,而在EGCG干預(yù)組,這些指標(biāo)都得到了不同程度的恢復(fù),說(shuō)明EGCG改善了經(jīng)