PC-1轉(zhuǎn)基因鼠模型構(gòu)建及相關(guān)基因FilaminA功能研究.pdf

1、1999年，周建光研究員篩選并克隆了PC-1基因。前期的研究表明，該基因在雄激素非依賴、可轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞C4-2中高表達(dá)，而在雄激素依賴、不轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞LNCaP中低表達(dá)；主要在前列腺組織特異性表達(dá)：表達(dá)受雄激素調(diào)控。推測其可能在前列腺癌由雄激素依賴到非依賴過渡中發(fā)揮一定的作用，其過表達(dá)可能與前列腺癌進(jìn)展相關(guān)。 本研究室早期還克隆得到了mPC-1基因上游1.1kb的啟動子序列。該啟動子具有相對明顯的前列腺細(xì)胞表達(dá)特異性

2、，其轉(zhuǎn)錄活性比前列腺特異性抗原PSA啟動子和人PC-1基因(hPC-1)5kb啟動子活性高很多。為了提高該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性并改善其組織特異性，對其進(jìn)行了改構(gòu)，獲得了14-ERE和23-ERE(本研究中稱為MPP)兩個新的啟動子。將14-ERE和23-ERE定向克隆到質(zhì)粒pGL3-Basic上，得到的質(zhì)粒命名為p14-ERE和p23-ERE。本研究采用雙熒光素酶活性檢測顯示，p14-ERE和p23-ERE在前列腺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，

3、但是在前列腺癌細(xì)胞中活性更高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與其它對照啟動子，如PSA-61，hPC-1 5kb啟動子等相比，14-ERE和23-ERE的活性明顯高得多。而且，在前列腺癌細(xì)胞中23-ERE活性比14-ERE高，在乳腺癌細(xì)胞中23-ERE活性比14-ERE低，即23-ERE具有更好的組織特異性。因此，本研究選擇23-ERE(MPP)作為前列腺特異性轉(zhuǎn)基因鼠載體的啟動子。 轉(zhuǎn)基因鼠模型在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究中發(fā)揮了重要

4、作用，同時也是研究特定基因體內(nèi)功能的重要方式。因此，在前期分子和細(xì)胞水平對．PC-1基因研究的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究PC-1基因的體內(nèi)功能及其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起的作用，本研究構(gòu)建了PC-1轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。該載體分為廣泛性和前列腺特異性兩類4種：pCAGGS-PC-1-XhoI、pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI和pMPP-PC-1、pMPP-PC-1-NdeI。其中，廣泛性表達(dá)載體以pCAGGS質(zhì)粒為基礎(chǔ)，pCAGG

5、S-PC-1-XhoI插入1個PC-1基因，pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI插入2個串聯(lián)PC-1基因，為了顯微注射時酶切方便，二者都插入了1個NotI位點(diǎn)：pMPP-PC-1、pMPP-PC-1-NdeI兩種前列腺特異性載體以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)，二者都含有MPP啟動子和1個PC-1基因，不同之處為二者的其他構(gòu)件，具體差別見附錄。Western Blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染pCAGGS-PC-1-XhoI和pCAGGS-

6、PC-1-PC-1-NotI質(zhì)粒的293T細(xì)胞中PC-1蛋白表達(dá)正常。另外，熒光顯微鏡觀測顯示，轉(zhuǎn)染pMPP-PC-1和pMPP-PC-1-NdeI質(zhì)粒的LNCaP細(xì)胞中，綠色熒光蛋白(EGFP)基因皆表達(dá)，但轉(zhuǎn)染pMPP-PC-1-NdeI質(zhì)粒的LNCaP細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)更強(qiáng)且數(shù)目更多。鑒于前列腺特異性表達(dá)載體更有利于研究，最終選擇pMPP-PC-1-NdeI載體用于顯微注射。 另一方面，為深入研究PC-1基因的功能，我們

7、利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到能夠與其相互作用的FilaminA分子(FLNa)。Filamin A是Actin結(jié)合蛋白，在不同類型細(xì)胞中廣泛表達(dá)，分子量280KD，以同源二聚體形式存在，結(jié)構(gòu)包含N-端和actin相作用的結(jié)構(gòu)域，以及24個由96個氨基酸串聯(lián)重復(fù)組成的結(jié)構(gòu)域。Filamin A是一個多功能蛋白分子，在細(xì)胞骨架的組裝、信號傳導(dǎo)、蛋白分子的細(xì)胞核定位等方面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ilamin A能夠在前列腺癌細(xì)胞中和雄激素受體(AR