人工合成甘藍(lán)型油菜的遺傳和表觀遺傳變異分析.pdf

1、異源多倍體在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了雜交與加倍，新基因組形成后會(huì)出現(xiàn)遺傳和表觀遺傳的變異現(xiàn)象，例如基因重排、基因組結(jié)構(gòu)變異、轉(zhuǎn)座子激活、基因表達(dá)水平和表達(dá)模式的變化及DNA甲基化變異等。因此，探究異源多倍體在形成早期發(fā)生變異的可能機(jī)制，對(duì)豐富多倍體進(jìn)化理論有重要的意義。異源四倍體甘藍(lán)型油菜（Brassica napusL.）由二倍體祖先種白菜（Brassica rapa L.）和甘藍(lán)（B.oleraceaL.）通過種間雜交后染色體加倍得到，因其

2、具有清晰系譜信息而成為研究植物異源多倍體化的重要對(duì)象之一。本實(shí)驗(yàn)以課題組前期人工合成的甘藍(lán)型油菜及其二倍體親本（白菜與甘藍(lán)）為材料，分析了人工合成甘藍(lán)型油菜形成早期在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方面與親本之間的差異;同時(shí)，利用RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)異源多倍化的甘藍(lán)型油菜基因組中基因與轉(zhuǎn)座子的表達(dá)變異特征進(jìn)行分析，從分子水平上探究甘藍(lán)型油菜基因組形成早期的基因組變異;另外，還利用分子標(biāo)記技術(shù)探究了人工合成甘藍(lán)型油菜多倍化過程中DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子的多態(tài)

3、性變異情況及可能的形成機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1、人工合成甘藍(lán)型油菜與二倍體親本表型比較分析
　　比較人工合成甘藍(lán)型油菜及其二倍體親本白菜和甘藍(lán)的形態(tài)學(xué)（如株型、葉片和花器官）和種子細(xì)胞學(xué)，發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍(lán)型油菜在表型上發(fā)生一系列變化，主要包括:
　　①植株株型較大且為松散型，有效分枝數(shù)較多，分枝部位較低，一次有效分枝的結(jié)角數(shù)較多，每角粒數(shù)變多等。
　　②葉表皮不光滑、葉脈有少量表皮毛，葉緣呈鋸齒狀且有表皮毛，

4、有葉耳。
　?、刍ò晷螒B(tài)與甘藍(lán)相似，花瓣顏色接近白菜，但花粉活力明顯比親本的強(qiáng)(分別為97.1％、92.1％和75.09％)。
　?、茉趩挝幻娣e內(nèi)葉表面氣孔數(shù)目增多、密度較大，但氣孔的長度和寬度比白菜小。
　　⑤利用光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡觀察和比較成熟種子內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果顯示:白菜、甘藍(lán)的種皮紋飾和網(wǎng)脊形態(tài)差異明顯，雜種后代種皮紋飾接近白菜、呈網(wǎng)紋狀，脊條粗短有微穴并與甘藍(lán)相似。白菜的柵欄層細(xì)胞呈深褐色，甘藍(lán)的柵

5、欄層細(xì)胞呈淡黃色，而雜種后代的柵欄層顏色介于兩個(gè)親本之間。雜種后代的糊粉層細(xì)胞最厚，甘藍(lán)的最薄。三者胚根中央分生細(xì)胞的蛋白體面積顯著低于胚根周圍薄壁細(xì)胞，而油體相對(duì)面積則相反;其中雜種后代中央分生細(xì)胞中的蛋白體面積最高，周圍薄壁細(xì)胞中蛋白體面積居于二者之間。雜種后代子葉中蛋白體積累最少，油體的體積最大且以長形為主，而兩親本子葉中蛋白體積累相對(duì)較多，油體較小呈圓形或橢圓形。
　　2、人工合成甘藍(lán)型油菜和二倍體親本的轉(zhuǎn)錄組比較研究

6、r>　　利用RNA-seq技術(shù)對(duì)人工合成的甘藍(lán)型油菜及其親本的葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，結(jié)果包括:
　?、僭诎撞诵陀筒?、甘藍(lán)及人工合成甘藍(lán)型油菜中檢測(cè)到表達(dá)的基因分別為21，491、21，947和40，544。甘藍(lán)型油菜與白菜相比有183個(gè)基因上調(diào)、2，192個(gè)基因下調(diào);與甘藍(lán)比較有548個(gè)基因上調(diào)、1，894個(gè)基因下調(diào)。這些后代與親本之間的差異表達(dá)基因主要與物質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、響應(yīng)脅迫等生物學(xué)過程有關(guān)。
　?、趯?duì)雜種后代中1

7、7，823對(duì)部分同源基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)部分同源基因(占63.77％)的表達(dá)模式與兩個(gè)親本的表達(dá)模式一致，可認(rèn)為多倍化過程中部分同源基因?qū)Φ谋磉_(dá)模式比較保守;通過部分同源基因?qū)Φ谋磉_(dá)偏好性分析發(fā)現(xiàn)12，221個(gè)基因的表達(dá)水平?jīng)]有差異，即它們不存在表達(dá)偏好性，另有2，322個(gè)部分同源基因?qū)ζ駻基因組表達(dá)，3，280個(gè)部分同源基因?qū)ζ駽基因組表達(dá)。
　?、蹖?duì)差異表達(dá)的部分同源基因?qū)M(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，713個(gè)基因以加性表達(dá)形

8、式出現(xiàn);分別有2，628個(gè)和3，162個(gè)基因以C-ELD(C-Expression Level dominance)和A-ELD(A-Expression Leveldominance)形式出現(xiàn);而超親下調(diào)或上調(diào)表達(dá)的基因有54個(gè)和1，056個(gè)?；蚬δ茏⑨尫治鲲@示C-ELD和A-ELD類型的基因與水楊酸合成、防御生物脅迫、MAPK途徑、RNA甲基化、核苷酸生物合成、rRNA加工及蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān);超親上調(diào)表達(dá)的基因涉及色素、類黃酮及有

9、機(jī)物等物質(zhì)的生物合成過程。
　　3、人工合成甘藍(lán)型油菜和二倍體親本轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)座子的分析
　　深入挖掘RNA-Seq數(shù)據(jù)，利用比較基因組學(xué)的手段從全基因組層面分析了人工合成甘藍(lán)型油菜與二倍體親本（甘藍(lán)和白菜）之間轉(zhuǎn)座子含量、種類和數(shù)量分布、表達(dá)模式及表達(dá)水平等方面的差異，結(jié)果表明:
　　①兩個(gè)親本轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)座子所占比例分別為32.56％和14.76％，人工合成甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)座子占的比例為18.09％。在三個(gè)物種轉(zhuǎn)錄

10、組中鑒定到了12種類型的轉(zhuǎn)座子(hAT、 CACTA、PIF-Harbinger、Mutator、Pong、Tc1/Mariner、Helitron、LTR/Copia、LTR/Gypsy、LTR/Unclassified、SINE和LINE)，其中占比例最多的是CACTA(2.02％～5.44％)、Pong(2.66～6.71％)、LTR/Copia(4.32％～10.90％)和LTR/Gypsy(2.20％～4.75％)，其他類型轉(zhuǎn)

11、座子在轉(zhuǎn)錄組中所占比例較?。s為0.09％～0.94％）。
　?、诟鶕?jù)RPKM值判斷轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平的差異，分析發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍(lán)型油菜與白菜相比有154個(gè)表達(dá)上調(diào)和162個(gè)表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)座子;與甘藍(lán)相比有147個(gè)表達(dá)上調(diào)和190個(gè)表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)座子;數(shù)目最多的差異表達(dá)轉(zhuǎn)座子是CAC TA、Pong、LTR/Copia、LTR/Gypsy和三TR/Unclassified。
　?、廴斯ず铣筛仕{(lán)型油菜中轉(zhuǎn)座子的表達(dá)模式主要以新出現(xiàn)、沉

12、默及只在一個(gè)親本和雜種后代中表達(dá)的模式出現(xiàn)。
　　④對(duì)轉(zhuǎn)座子插入基因內(nèi)部的偏好性分析發(fā)現(xiàn)，基因內(nèi)含子區(qū)域比外顯子區(qū)更容易插入轉(zhuǎn)座子;對(duì)有轉(zhuǎn)座子插入的基因注釋分析，顯示這部分基因涉及細(xì)胞組分、生物進(jìn)程和分子功能三個(gè)方面。細(xì)胞組分方面主要與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體、質(zhì)膜及色素等有關(guān);生物進(jìn)程方面主要與蛋白質(zhì)代謝、抵抗脅迫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞組成和生物轉(zhuǎn)化、其他代謝途徑和細(xì)胞化進(jìn)程等有關(guān);分子功能方面與核苷酸結(jié)合、DNA(或RNA)結(jié)合、蛋白

13、結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶和其他酶活性有關(guān)。這些結(jié)果暗示著轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組結(jié)構(gòu)的形成和基因功能的發(fā)揮有重要作用。
　　4、人工合成甘藍(lán)型油菜基因組中的反轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)錄酶序列分析
　　采用反轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記方法（Inter-Retrotransposon AmplifiedPolymorphism，IRAP）對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜全基因組中的反轉(zhuǎn)座子的變化規(guī)律和可能作用機(jī)制進(jìn)行分析;同時(shí)也對(duì)反轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶序列構(gòu)

14、成和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。
　　結(jié)果表明:
　?、?77對(duì)反轉(zhuǎn)座子引物進(jìn)行隨機(jī)組合，共擴(kuò)增出1，729個(gè)條帶，親本條帶占71.13％，雜種中消失與新增的條帶分別占5.73％和7.63％，未知條帶占15.50％，多倍化過程中反轉(zhuǎn)座子的激活頻率為0.134。
　　②成功克隆了70條包含有反轉(zhuǎn)座子的序列，并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示有反轉(zhuǎn)座子插入的基因主要與分子功能、生物進(jìn)程及細(xì)胞組分三方面，其中比例最多的是催化或結(jié)合、特殊大分

15、子復(fù)合物、內(nèi)膜系統(tǒng)、其他代謝過程等。這說明基因和反轉(zhuǎn)座子之間有緊密關(guān)系，可能對(duì)多倍體適應(yīng)新環(huán)境有重要意義。
　?、劾眉娌⒁飳?duì)反轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行擴(kuò)增，成功分離和克隆了32條反轉(zhuǎn)錄酶序列，核苷酸序列長度變化范圍為275～284 bp，氨基酸序列中包含三個(gè)保守區(qū):TAFLHG、LYGLKQ和YVDDM，這說明反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列具有同源性和高度異質(zhì)性的特點(diǎn)。將克隆的序列與其他物種反轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)它們具有同源

16、性，這意味著不同物種中的反轉(zhuǎn)座子在物種形成前可能擁有共同的祖先。
　　5、人工合成甘藍(lán)型油菜早期世代DNA甲基化的變化分析
　　DNA甲基化作為常見的表觀遺傳修飾，在多倍化過程中起著重要的作用。本研究以人工合成甘藍(lán)型油菜早期世代(F1，S1-S3)及其親本白菜型油菜和甘藍(lán)為實(shí)驗(yàn)材料，通過DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP）技術(shù)

17、和高效液相色譜(High Performance LiquidChromatography,HPLC)技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜多倍化過程中DNA甲基化水平的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。
　　結(jié)果表明:
　?、僭贔1中有53.4％的片段是來源于A和C基因組。除此之外，在雜種后代中分別有5.04％和8.87％的片段是屬于新增帶和消失帶。
　?、谂c二倍體親本相比，人工合成甘藍(lán)型油菜F1代中有13.1％的基因位點(diǎn)發(fā)生了甲基化的改變，其中有7.8

18、6％的位點(diǎn)屬于高甲基化，5.24％的位點(diǎn)屬于DNA甲基化。利用MSAP技術(shù)比較人工合成甘藍(lán)型油菜F1及S1-S3代中的DNA甲基化水平差異，發(fā)現(xiàn)F1的甲基化水平最低(38.7％)，S3世代中的甲基化水平最高(41.32％)。對(duì)DNA甲基化變異片段進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)其廣泛參與了多種生物學(xué)途徑，包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在不同的材料之中甲基化酶基因的表達(dá)水平與DNA甲基化狀態(tài)是一致