肺鱗癌A2細胞膜上電壓激活性鉀電流與細胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。在很多發(fā)達國家中,肺癌在男性常見腫瘤中占首位,在女性常見腫瘤中占第二或三位。近半個世紀(jì)以來,世界各國肺癌的發(fā)病率與死亡率都急劇上升,我國也不例外。據(jù)調(diào)查表明,在我國肺癌的發(fā)病率城市高于農(nóng)村;在北京、上海、天津等城市肺癌已占惡性腫瘤發(fā)病率的首位。
　　我國肺癌死亡率有上升趨勢,對于這一發(fā)病率日益增長的腫瘤,盡管投入了大量的人力物力進行研究,但令人遺憾的是,治療效果一直不盡人意。近年來,隨著膜片鉗技術(shù)和分子

2、生物學(xué)技術(shù)的進展,以及在腫瘤細胞膜離子通道研究中的應(yīng)用,腫瘤細胞膜離子通道的研究已成為新的潮流,離子通道是細胞膜上的跨膜蛋白質(zhì)分子,是一種具有選擇性的允許適當(dāng)電荷離子通過的親水性微孔道,聯(lián)系著細胞內(nèi)部和外部環(huán)境。
　　研究發(fā)現(xiàn),離子通道與腫瘤有密切關(guān)系,而鉀離子通道是細胞膜上分布最廣、類型最多的一類離子通道,發(fā)揮許多重要的生物功能,是作為抗腫瘤藥物的重要靶點。自從1976年Erwin Nether和Bert Sakmann建立膜片

3、鉗(patch clamp)技術(shù)、離子通道,特別是心肌平滑肌細胞離子通道研究快速發(fā)展起來,深入研究細胞膜離子通道改變在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到人們的重視?，F(xiàn)有的研究表明肺癌相關(guān)基因的表達、缺失或突變常常是通過細胞膜信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和細胞膜離子通道實現(xiàn)的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)細胞膜離子通道在細胞癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號傳導(dǎo)、基因表達等方面亦起十分重要的作用,在細胞癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中常伴有細胞膜離子通道結(jié)構(gòu)和功能的異常。

4、1999年,Yao等報道在結(jié)腸癌傳代細胞膜上有一種電壓門控性鉀通道表達異常;1999年,Klimatcheva等報道在乳腺癌細胞膜上有鉀通道表達異常;另有報道在研究神經(jīng)纖維瘤、垂體瘤等細胞膜電位時,記錄到一種新型的內(nèi)向整流鉀電流。
　　迄今,有關(guān)肺鱗癌細胞膜鉀通道的研究,尚未見到相關(guān)報道,本研究通過觀察人肺鱗癌A2細胞膜電壓門控性K+電流的特性及鉀通道阻斷劑四乙胺(TEA)對鱗癌細胞K+電流和細胞增殖的影響,探討應(yīng)用鉀通道阻斷劑抑

5、制肺鱗癌細胞增殖的可行性,為該領(lǐng)域的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采用肺鱗癌細胞株A2為研究對象,培養(yǎng)24h-72h后,選擇單個貼壁良好、立體感光強、折光性較好、單個排列和表面光滑的細胞備用。1.細胞電生理實驗:用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄細胞膜離子通道特性。將微推進器推進微管電極尖端貼至細胞膜,負壓抽吸形成高阻封接,并吸破細胞膜形成全細胞膜片;采用逐步去極化誘發(fā)出鱗癌A2細胞的外向鉀離子電流,然后將5mmol/L的TEA加至細胞浴液

6、中,記錄TEA對K+電流的影響。2.細胞體外增殖實驗:用四甲基偶氮唑鹽比色試驗(MTT法)檢測1、2、5和10mmol/L的TEA分別作用細胞12h、24h、36h和48h,然后在570nm波長下用酶聯(lián)檢測吸光度值(A),比較不同TEA組對細胞增殖的影響。3.用Hoechst33258染色檢測細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:1.全細胞膜片鉗記錄模式下,采用電壓鉗制方式,使A2細胞在測試電壓范圍為-40至+80mV,保持電壓為-7

7、0mV時,刺激時間為500ms,隨著測試電壓的增大,鉀離子電流幅值也增加,說明其具有電壓依賴性。2.記錄到A2細胞膜離子電流后,用加藥裝置將K+通道阻斷劑TEA加到浴液,在相同保持電壓和測試方案下觀察該離子電流的變化。結(jié)果當(dāng)加入浴液5mmol/L的TEA后,可見跨膜離子電流峰值明顯降低。3.MTT實驗結(jié)果顯示,TEA對A2細胞增殖的抑制作用具有時間和劑量相關(guān)的特點,當(dāng)TEA濃度≥2mmol/L時,對A2細胞增殖抑制效應(yīng)明顯。4.經(jīng)Hoe

8、chst33258染色后在熒光顯微鏡下觀察,5mmol/L TEA作用48h后,可見具有凋亡形態(tài)特征的A2細胞。
　　結(jié)論:1.人肺鱗癌A2細胞膜上存在鉀離子通道。該通道特性:①離子電流隨測試電壓的增大而增大,其具有電壓依賴性;②肺鱗癌A2細胞膜鉀離子通道最大鉀電流密度為112.35±7.53pA/pF③鱗癌細胞膜電容為14.13±0.45pF。2.在不同測試電壓下,肺鱗癌A2細胞膜上鉀離子電流隨著鉀離子通道阻斷劑TEA的加入,其