ETEC F41菌毛基因的原核表達及其重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起人和幼畜(初生仔豬、犢牛、羔羊、斷奶仔豬)腹瀉的重要病原之一。我國乃至世界因ETEC引起的新生幼畜腹瀉發(fā)病率和死亡率都很高,給畜牧業(yè)帶來了極大危害,造成了巨大的經(jīng)濟損失。ETEC的致病力與其黏附素性菌毛和腸毒素二者密切相關(guān)且缺一不可,黏附素性菌毛的黏附作用是該菌致病的先決條件。因此,以抗黏附免疫為基礎(chǔ)的黏附素疫苗的研制是疫苗研制的重點。

2、F41菌毛是ETEC所攜帶的主要菌毛抗原之一,是研發(fā)新型疫苗的理想候選抗原。目前國內(nèi)對于構(gòu)建單一F41菌毛基因工程菌株的研究未見報道。 本文利用PCR技術(shù)從牛源ETEC標準菌株C83919的染色體DNA中擴增出F41菌毛基因,構(gòu)建T7啟動子控制下的原核表達載體pEF-32a(+)-F41,對其進行序列分析,結(jié)果表明:與GenBank中公布的序列相比較,DNA一致性在99.6%以上;將重組子轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21(DE3

3、)中,IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析,均可見約49.8kDa的目的蛋白帶,且目的蛋白主要存在于菌體裂解上清中,為可溶性表達;對表達條件進行了優(yōu)化,經(jīng)Bandscan軟件分析,表達的目的蛋白約占菌體總蛋白的32%;通過Ni-NTA agarose純化,獲得較高純度的重組蛋白,經(jīng)基因定量儀測定其濃度可達1.84mg/mL;以其免疫家兔獲得多抗血清,Western blot分析證實該重組蛋白具有良好的抗原性,

4、可以作為診斷抗原。 為考察所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-F41在E.coli BL21(DE3)菌種中的遺傳穩(wěn)定性,將菌種分別在氨芐青霉素選擇平板和非選擇平板上連續(xù)傳代至50代,對菌落計數(shù),計算分離穩(wěn)定性達到95%以上;觀察傳代后菌落及菌體形態(tài)依然保持了原代菌體形態(tài)特征;提取原代、30代、40代、50代質(zhì)粒DNA進行雙酶切檢查,酶切圖譜沒有改變;對傳代前后菌株進行誘導(dǎo)表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析

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