幽門螺桿菌尿素酶B亞單位HLA限制性CD4+T細(xì)胞表位的篩選與鑒定.pdf

1、[背景和目的]
　　全球50％以上的人群存在著幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)的感染,其感染與胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)和胃癌等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。面對(duì)H.pylori的高感染率和嚴(yán)重的致病性,國(guó)內(nèi)外已廣泛開展H.pylori疫苗研究。然而,現(xiàn)有疫苗的免疫保護(hù)效果都十分有限?全菌疫苗的抗原組成復(fù)雜,誘發(fā)的免疫應(yīng)答混亂,甚至包含有害的反應(yīng);一些亞單位疫苗在動(dòng)物模型上取得

2、了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,卻因人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MHC分子差異,導(dǎo)致臨床實(shí)驗(yàn)的失敗?表位疫苗是基于誘發(fā)免疫應(yīng)答最基本的功能單位——表位來(lái)設(shè)計(jì)的疫苗。通過控制表位的組成能夠精確控制疫苗所誘發(fā)的免疫應(yīng)答類型。與傳統(tǒng)疫苗相比,其更加高效,針對(duì)性更強(qiáng)。目前,已廣泛應(yīng)用于感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病的疫苗設(shè)計(jì)研發(fā)之中。
　　表位的篩選和鑒定是表位疫苗研制的關(guān)鍵。研究表明在抗H.pylori感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答中,CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。

3、同時(shí),相對(duì)于亞優(yōu)勢(shì)表位和隱性表位,只有免疫優(yōu)勢(shì)表位才能夠誘發(fā)最為強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。因此,免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位是H.pylori表位疫苗所必須的。
　　尿素酶B亞單位(Ureasesubunitbeta,UreB)作為H.pylori重要的定植因子和毒力因子,具有較高的保守性和較強(qiáng)的免疫原性,小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有很好的免疫保護(hù)效果,被認(rèn)為是最佳的疫苗候選抗原之一。本課題組前期已經(jīng)鑒定出3個(gè)UreB來(lái)源的小鼠H-2d限制性CD4+T

4、細(xì)胞表位,用這些表位組成的表位疫苗能夠顯著降低幽門螺桿菌在胃內(nèi)的定植數(shù)量。然而,由于人與小鼠MHC分子的差異,這些表位很難在人體中誘發(fā)免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。因此,本研究擬對(duì)UreB來(lái)源的HLA限制性CD4+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行篩選鑒定,為H.pylori表位疫苗的設(shè)計(jì)提供候選表位。
　　[方法]
　　通過13C尿素呼氣實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)ELISA實(shí)驗(yàn)篩選H.pylori感染陽(yáng)性患者,收集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用重組的Ur

5、eB蛋白對(duì)H.pylori感染者外周血中UreB特異性CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增;再通過步移重疊合成肽法對(duì)這些特異性CD4+T細(xì)胞所識(shí)別的免疫優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行系統(tǒng)的篩選和鑒定。通過HLA-II類分子抗體阻斷法對(duì)表位的限制性主型進(jìn)行分析,再利用帶有不同HLA-II類分子亞型的BLCL表位遞呈實(shí)驗(yàn)對(duì)表位的限制性亞型進(jìn)行鑒定。最后,通過樹突細(xì)胞負(fù)載重組UreB蛋白或H.pylori全菌抗原對(duì)表位的自然遞呈特性進(jìn)行鑒定。
　　[結(jié)果]

6、r>　　1、通過13C尿素呼氣實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)ELISA實(shí)驗(yàn)篩選出兩個(gè)H.pylori感染陽(yáng)性患者,樣本編號(hào)分別為4529和4493。
　　2、通過重組UreB抗原體外刺激擴(kuò)增后,4529和4493個(gè)體來(lái)源的PBMC中UreB特異性CD4+T細(xì)胞頻率分別為2.34%和1.64%。
　　3、步移重疊18mer肽篩選顯示4529和4493個(gè)體來(lái)源的UreB特異性CD4+T細(xì)胞識(shí)別的優(yōu)勢(shì)表位分別位于UreB373–390和UreB43

7、9-456區(qū)域。
　　4、步移重疊13mer肽和截短肽段篩選顯示免疫優(yōu)勢(shì)表位的核心序列在4529和4493個(gè)體中分別為UreB373–385和UreB438–452。
　　5、通過抗體阻斷分析顯示這兩個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位均屬于HLA-DR限制性。
　　6、不同HLA亞型BCL表位遞呈實(shí)驗(yàn)分析顯示表位UreB373–385限制性亞型為DRB1*1404,表位UreB438–452的限制性亞型為DRB1*0803。
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8、、體外自然遞呈實(shí)驗(yàn)證實(shí),兩個(gè)新的免疫優(yōu)勢(shì)表位的特異性T細(xì)胞均能識(shí)別負(fù)載重組UreB抗原或幽門螺桿菌全菌細(xì)胞裂解物的自體DC細(xì)胞。
　　[結(jié)論]
　　本研究從幽門螺桿菌UreB抗原中篩選鑒定到兩個(gè)新的HLA限制性免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位:DRB1*1404限制性的UreB373–385和DRB1*0803限制性的UreB438–452。這兩個(gè)表位均能被抗原遞呈細(xì)胞自然加工遞呈,這將為H.pylori表位疫苗的設(shè)計(jì)提供候選表位