豬偽狂犬病毒GXLB-2015和GXGG-2016毒株的全基因組序列分析和生物學(xué)特性研究.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是一種能夠引起多種動(dòng)物發(fā)病的傳染病，豬（包括野豬）是唯一的自然宿主。豬偽狂犬病能導(dǎo)致成年種豬繁殖功能障礙、懷孕母豬流產(chǎn)、新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀且死亡率高，一旦感染該病則終生帶毒。自2012年來(lái)，在我國(guó)多個(gè)免疫Bartha-K61疫苗的豬場(chǎng)相繼爆發(fā)了PR。為了了解廣西PRV流行趨勢(shì)、基因遺傳變化規(guī)律和變異特點(diǎn)，豐富豬偽狂犬病毒全序列數(shù)據(jù)庫(kù)以及從生物學(xué)特性上探索其致病性差異，本文為該病的防控以及研制更

2、有效更安全的疫苗提供理論依據(jù)。
　　2013-2016年，本實(shí)驗(yàn)室共分離得到34株偽狂犬病毒，通過對(duì)PRV的5個(gè)毒力基因進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)廣西來(lái)賓一株病毒（GXLB-2015株）的五個(gè)毒力基因處于兩個(gè)不同遺傳進(jìn)化分支上，廣西貴港一株病毒（GXGG-2016株）TK基因存在缺失。本研究對(duì)PRV GXLB-2015和GXGG-2016株進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析。同時(shí)將測(cè)序得到的序列與NCBI上已發(fā)表的PRV基因組全序列進(jìn)行比對(duì)，并用Sim

3、plot軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，GXLB-2015全長(zhǎng)143656bp，存在同源重組情況，是國(guó)外疫苗株Bartha和國(guó)內(nèi)變異株的重組毒株;GXGG-2016全長(zhǎng)142264bp，在TK基因上連續(xù)缺失69個(gè)氨基酸，缺失位點(diǎn)與HB-98的人工缺失位點(diǎn)一致。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)GXLB-2015位于國(guó)外株與國(guó)內(nèi)變異株之間，GXGG-2016位于國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)株的分支上。進(jìn)行核苷酸同源性比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，GXLB-2015和GXGG-2016與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的全序

4、列同源性分別為95.48-98.83％和94.76-99.54％。GXLB-2015在UL區(qū)的基因上與Bartha保持高度一致，但在病毒的US區(qū)基因上與國(guó)內(nèi)變異株處在同一遺傳進(jìn)化樹分支。GXGG-2016在全序列的各個(gè)基因上均與國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)株保持高度同源。
　　為分析這兩株毒株的體外生長(zhǎng)特性和小鼠致病性，特選取疫苗毒株Bartha和HB-98，以及本實(shí)驗(yàn)室已分離得到的傳統(tǒng)株GXLB-2013和變異株GXNN-2014進(jìn)行比較。多步生長(zhǎng)

5、曲線結(jié)果顯示，不同毒株均在4h后可以檢測(cè)到病毒，48h后達(dá)到病毒滴度高峰，值得注意的是，GXGG-2016毒株在增殖20-24h時(shí)病毒滴度增長(zhǎng)加快，比其他毒株高10倍以上?？瞻邔?shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同PRV毒株對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的噬斑大小有差異，變異株GXNN-2014株所產(chǎn)生的的空斑最大，其次是傳統(tǒng)株GXLB-2013和GXLB-2015株，說明變異株對(duì)細(xì)胞的感染噬性最強(qiáng)，而GXGG-2016缺失了TK后空斑明顯小于其他毒株。
　　小鼠的致病

6、性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GXLB-2015的小鼠致病力最強(qiáng)，LD50為1035TCID50，變異株GXNN-2014次之;而GXGG-2016對(duì)小白鼠不致死，無(wú)明顯臨床癥狀。檢測(cè)小鼠腦組織PRV病毒含量時(shí)發(fā)現(xiàn)僅能從發(fā)病死亡小鼠腦組織檢測(cè)到PRV。小白鼠致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組毒株GXLB-2015對(duì)小白鼠的致病性最強(qiáng)，癥狀最嚴(yán)重。而缺失TK基因69個(gè)氨基酸的GXGG-2016株對(duì)小白鼠不致病。本研究豐富了我國(guó)PRV的病毒數(shù)據(jù)庫(kù)，為認(rèn)識(shí)和防控PRV