小鼠嗜酸性細(xì)胞CCR3基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：
　　 掌握小鼠嗜酸性細(xì)胞CCR3基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建方法，通過慢病毒載體的構(gòu)建，降低CCR3基因在嗜酸性細(xì)胞中的表達(dá)，從而為探討阻斷Eotaxin/CCR3路徑對(duì)嗜酸性細(xì)胞凋亡及其在骨髓、外周血及局部組織的募集、遷移及成熟過程的機(jī)制變化影響創(chuàng)造條件。
　　 方法：
　　 利用公用網(wǎng)站按照RNAi序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)RNAi靶點(diǎn)序列并合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng) MluⅠ

2、、SacⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切后的pLVX-shRNA2-m載體連接產(chǎn)生shRNA慢病毒載體。應(yīng)用shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度，Q-PCR鑒定CCR3基因在嗜酸性細(xì)胞中的下調(diào)作用。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建了shRNA-mCCR3慢病毒載體，經(jīng)測(cè)序與設(shè)計(jì)合成的靶向鏈完全一致。熒光顯微鏡下觀察293T細(xì)胞感染效率大于90％，病毒滴度為4X108TU

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