重組雙鏈腺相關(guān)病毒表達Exendin-4對2型糖尿病大鼠模型的治療作用.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建表達Exendin-4重組雙鏈腺相關(guān)病毒(dsAAV)載體,包裝并檢測重組病毒轉(zhuǎn)染細胞效率及表達Exendin-4濃度,觀察重組dsAAV治療2型糖尿病大鼠模型效果。
　　方法:
　　重疊延伸PCR擴增Exendin-4基因片段,應(yīng)用基因工程方法構(gòu)建加有神經(jīng)營養(yǎng)因子4信號肽的dsAAV載體pSSHG/NT4-Exendin-4,使用表達GFP的對照AAV轉(zhuǎn)染 NIH3T3細胞觀察轉(zhuǎn)染效率,ELISA法檢

2、測重組病毒轉(zhuǎn)染 NIH3T3細胞上清Exendin-4濃度,同時與ssAAV比較;注射重組dsAAV于糖尿病大鼠模型頜下腺,分別于2、4、6及第8周檢測血糖水平、胰島素濃度,免疫組化方法檢測頜下腺Exendin-4及胰島素的表達。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)限制性內(nèi)切酶及測序證實載體構(gòu)建成功,測定重組 dsAAV滴度為2.5×1011pfu,較ssAA滴度高(2.5×109 pfu);dsAAV/GFP轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞表達綠色熒

3、光強;ELISA法檢測感染dsAAV的NIH3T3細胞上清中Exendin-4的濃度為181.1±8.75pmol/ml,較 ssAAV分泌濃度(133.81±8.09pmol/ml)升高(p<0.05);dsAAV/Exendin-4治療組鼠血糖控制良好,增加胰島素分泌,與對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05)。治療組大鼠頜下腺 Exendin-4及胰島素免疫組織化學染色陽性。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建、包裝可表達 E