脊髓背角P2Y13受體參與CCI大鼠病理性疼痛的機制探討.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛是由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)病變等引起的慢性疼痛，其特征性的臨床表現(xiàn)有疼痛過敏、異常疼痛和自發(fā)痛等。這種慢性疼痛往往影響了患者的生活質(zhì)量，并帶來沉重的精神、心理及經(jīng)濟負擔。目前臨床上總體療效不佳。闡明疼痛的產(chǎn)生機理對于發(fā)展新的鎮(zhèn)痛藥物和治療方法是必不可缺的。近年研究報道，背角小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中起著重要作用。激活的脊髓背角小膠質(zhì)細胞可以通過釋放一些細胞因子和趨化因子促進傷害性信息的傳遞。P2Y13受體表達于背

2、角小膠質(zhì)細胞，但P2Y13受體是否可以通過調(diào)節(jié)脊髓背角小膠質(zhì)細胞的活性，參與脊髓水平痛覺信息的整合尚有待研究。本課題擬在以往本實驗室對嘌呤 P2受體研究的基礎上，制作大鼠坐骨神經(jīng)痛模型，分別采用在體和離體兩方面研究，綜合應用行為學、形態(tài)學、分子生物學方法，觀察記錄：1）P2Y13受體阻斷前后，坐骨神經(jīng)縮窄性損傷后大鼠的行為學變化；2）P2Y13受體阻斷前后，脊髓背角小膠質(zhì)細胞功能變化；3） P2Y13受體阻斷對于ADP誘發(fā)背角小膠質(zhì)細胞

3、Ca2+變化的影響。本課題從不同角度探討P2Y13受體對小膠質(zhì)細胞功能的影響，這將有助于為病理性疼痛的機理研究提供新的思路，為以小膠質(zhì)細胞為靶點開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥提供理論基礎。
　　目的：1．明確脊髓背角P2Y13受體是否參與CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛。
　　2．明確P2Y13受體是否可以促進脊髓背角小膠質(zhì)細胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度上調(diào)。
　　方法：實驗所用動物均購置于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。
　　（1）健康成年雄性SD

4、大鼠隨機分為3組(n=8): sham組、CCI模型組(鞘內(nèi)注射生理鹽水)、MRS2211(P2Y13受體拮抗劑)處理組（CCI+鞘內(nèi)注射100pmol/L MRS2211）。CCI模型組及MRS2211處理組大鼠均于鞘內(nèi)置管7d之后建立坐骨神經(jīng)縮窄性損傷模型（CCI），連續(xù)14d鞘內(nèi)注射生理鹽水或MRS2211（100pmol/L），2次/d，分別在術前1d、術后第1，3，5，7，10，14d測定給藥1h后熱縮足潛伏期（TWL）；分別

5、在第7，14d處死大鼠，取脊髓背角做免疫印跡，觀察背角P2X4受體和P38MAPK表達變化。
　?。?）培養(yǎng)純化新生SD大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞，免疫組化觀察P2Y13受體表達，激光共聚焦顯微鏡檢測ADP作用下，小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i的變化；隨后觀察MRS2211、MRS2179、MRS2395預處理對于ADP誘發(fā)小膠質(zhì)細胞Ca2+動員的影響。
　　結(jié)果：（1）CCI術后1d大鼠即可形成穩(wěn)定的熱痛敏，與sham組相比，CCI

6、組大鼠術后第1，3，5，7，10，14d TWL明顯縮短（P＜0.01）；與CCI組相比，MRS2211處理組術后第1，3，5，7，10，14d TWL明顯延長（P＜0.05）。免疫印跡觀察到，與sham組相比，CCI組術后第7d P2X4受體表達上調(diào)（P＜0.05），在第14d P2X4受體表達上調(diào)更為明顯（P＜0.05）；與sham組相比，CCI組術后第7d P38MAPK表達明顯上調(diào)（P＜0.05)，在第14d P38MAPK表達

7、有所下降，但與sham組相比仍具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；與CCI組相比，MRS2211處理組大鼠術后第7d背角P38MAPK表達上調(diào)明顯減弱（P＜0.05)，但在第14d P38MAPK表達有所上升，但與 CCI組相比仍具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；此外，鞘內(nèi)注射 MRS2211并不影響CCI大鼠脊髓背角P2X4受體表達變化。
　　（2）免疫組化實驗觀察到，在離體培養(yǎng)的大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞表達P2Y13受體，ADP可引起

8、培養(yǎng)的脊髓背角小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i快速增高，且呈現(xiàn)劑量依賴性；P2Y13受體拮抗劑 MRS2211(100μmol/L)可以阻斷 ADP的作用，而P2Y1受體拮抗劑MRS2179(100μmol/L)、P2Y12受體拮抗劑MRS2395(100μmol/L)均不影響ADP引起的小膠質(zhì)細胞[Ca2+] i升高的效應。
　　結(jié)論：
　　1.鞘內(nèi)注射P2Y13受體拮抗劑MRS2211可以明顯抑制CCI大鼠熱痛敏癥狀，脊髓背角P