三化湯改善大鼠早期缺血性腦水腫水通道蛋白-4機(jī)制.pdf

1、目的： (1)觀察腦缺血再灌注后水通道蛋白-4表達(dá)變化，及其與缺血再灌注后腦水腫之間的關(guān)系。 (2)研究腦缺血再灌注后，AQP4的表達(dá)變化與血腦屏障通透性之間的關(guān)系。 (3)研究腦缺血再灌注后，三化湯對(duì)AQP4表達(dá)和血腦屏障通透性的影響，探討三化湯改善大鼠缺血性腦水腫的作用機(jī)制。 方法：225只健康成年SD大鼠，隨機(jī)分成缺血再灌注組、假手術(shù)對(duì)照組、給藥組。線栓法制作腦缺血的動(dòng)物模型，缺血2h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)

2、再灌注，假于術(shù)組除不插線栓，其余操作與缺血再灌注組相同。模型制作前，缺血再灌注組、假手術(shù)對(duì)照組每只大鼠先用生理鹽水(10ml/Kg/d)灌胃3天，給藥組每只大鼠先用三化湯(10ml/Kg/d)灌胃3天。定模型缺血2h為第0時(shí)，缺血再灌注組、假于術(shù)對(duì)照組組于處死前繼續(xù)以生理鹽水(10ml/Kg/d)灌胃3天，給藥組于處死前繼續(xù)以生理鹽水(10ml/Kg/d)灌胃3天，于再灌注后6h、12h、24h、48h、72h，評(píng)價(jià)各組動(dòng)物神經(jīng)功能缺損

3、并取出大鼠腦組織用于以下實(shí)驗(yàn)：(1)4％多聚甲醛灌注固定后留取大腦標(biāo)本HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，透射電鏡下觀察缺血后血腦屏障和細(xì)胞的超微病理改變(2)取新鮮腦組織標(biāo)本，用干濕重法計(jì)算腦組織含水量，測(cè)缺血腦組織中伊文思藍(lán)外滲的量，以EB外滲的量反應(yīng)BBB通透性的變化。(3)免疫組化和RT-PCR檢測(cè)AQP4及其mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果： (1)神經(jīng)功能缺損評(píng)分：NC組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均為0分，即無(wú)神經(jīng)功能缺損。缺血再灌注

4、組、給藥組各時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損。 (2)形態(tài)學(xué)觀察：HE染色示對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞分布層次清楚，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。模型組、給藥組HE染色可見(jiàn)腦組織出現(xiàn)缺血性改變，細(xì)胞及血管周圍間隙明顯擴(kuò)大，部分細(xì)胞壞死，胞核濃染或消失，膠質(zhì)細(xì)胞增生。透射電鏡下可見(jiàn)血管及其周圍神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)有明顯改變，神經(jīng)細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集、胞膜破裂，毛細(xì)血管周圍間隙擴(kuò)大，在CIR48～72h改變最明顯。 (2)CIR12后，

5、模型組腦含水量開(kāi)始升高，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；三化湯組CIR12h后各時(shí)間點(diǎn)腦含水量均明顯低于模型組(P均＜0.05)。 (3)假手術(shù)組EB含量無(wú)明顯改變。CIR組EB含量隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；且EB含量的增加出現(xiàn)兩個(gè)高峰，分別在CIR12h和48h，后者增加更明顯。EB含量的增加與AQP4表達(dá)呈正相關(guān)，r=0.90，P＜0.05。三化湯組CIR6h后各時(shí)間點(diǎn)腦含水量均明顯低于模型組(P均

6、＜0.05)。 (4)AQP4蛋白表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示AQP4陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)于缺血灶及周圍的皮質(zhì)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞最為明顯，另外在膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞也有AQP4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。CIR6h后，梗塞區(qū)部分組織深染，細(xì)胞腫大，梗塞區(qū)周圍見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增多，胞核及胞漿未見(jiàn)著色。MCA012h后梗塞區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞的體積增大，染色進(jìn)一步增強(qiáng)。MCA024h后梗塞區(qū)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，觀察到少量完整的陽(yáng)性細(xì)胞體，而梗塞區(qū)周圍可見(jiàn)更多的陽(yáng)性細(xì)胞。MCA

7、048h-72h后梗塞區(qū)呈強(qiáng)陽(yáng)性，梗塞區(qū)周圍的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與梗塞的時(shí)間呈正相關(guān)，三化湯組AQP4表達(dá)也呈上升趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)與假于術(shù)組比較差異顯著(P均＜0.05)。 (5)AOP4mRNA表達(dá)：模型組在CIR6h后AQP4mRNA表達(dá)開(kāi)始升高，并逐漸升高到較高水平，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，三化湯組AOP4mRNA表達(dá)也隨時(shí)間的推移逐步增高，但各時(shí)間點(diǎn)AQP4mRNA表達(dá)都較模

8、型組低(P均＜0.05)。 結(jié)論： (1)腦缺血再灌注后，伴隨腦水腫加重，AQP4表達(dá)上調(diào)。提示腦缺血再灌注后AQP4的表達(dá)變化與腦水腫的形成密切相關(guān)，AQP4在腦缺血再灌注后腦水腫的形成中發(fā)揮著重要作用。 (2)缺血再灌注后BBB通透性的增加與腦水腫的形成密切相關(guān)，CIR后BBB通透性增加，可能與AQP4表達(dá)上調(diào)有關(guān)，兩者的變化影響CIR后腦水腫的發(fā)生、發(fā)展。 (3)三化湯能減輕CIR后早期腦含水量及血