線粒體DNA繼發(fā)突變對(duì)Leber遺傳性視神經(jīng)病變G11778A家系表型表達(dá)的影響.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者篩查及資料收集 目的： 1.在全國(guó)各地收集視神經(jīng)病變家系，建立臨床資料和分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫(kù)。并收集191個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的正常人作為正常對(duì)照。 2.對(duì)收集到的家系及正常對(duì)照mtDNA三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)(G3460A、G11778A、T14484C)進(jìn)行檢測(cè)，了解中國(guó)人群的突變頻譜。 材料與方法： 1.通過(guò)溫州醫(yī)學(xué)院眼視光醫(yī)院與北京中醫(yī)藥大

2、學(xué)東方醫(yī)院眼科和福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院合作，建立起視神經(jīng)病變家系收集網(wǎng)絡(luò)，另外還有全國(guó)各地醫(yī)院和科研院所送來(lái)的少量家系資料。經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院倫理道德委員會(huì)及辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心委員會(huì)許可，病人及所有受試者同意，簽署知情同意書，采集血樣，了解家系情況，并建好數(shù)據(jù)庫(kù)。 2.對(duì)試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行眼科臨床檢查，包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)視力表檢測(cè)視力，俞自萍色覺圖檢查，Humphrey視野計(jì)按程序SITA檢查(HumphreyVisualFieldAna

3、lyzerIIi，SITAStandard)，德國(guó)羅蘭電生理儀(RolandConsultRETIportgamma，patternorflashVEP)檢查視覺誘發(fā)電位(VEP)以及佳能眼底數(shù)碼彩照(CanonCR6-45NMfunduscamera)拍攝眼底。 3.對(duì)采集的血樣提取基因組DNA，并設(shè)計(jì)包含三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)的三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序。 4.使用生物軟件(DNAStar、Choromas、Clust

4、alX)分析測(cè)序結(jié)果，找出所有的多態(tài)性位點(diǎn)和突變位點(diǎn)，分析mtDNA突變對(duì)LHON表型表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.我們共收集了496個(gè)視神經(jīng)病變的家系，檢測(cè)出LHON三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)的家系共208個(gè)。其中，攜帶G11778A、G3460A和T14484C突變的家系數(shù)分別為175、5和28個(gè)。 2.收集到的家系中攜帶繼發(fā)突變(G3316A、T3394C、C3497T、A3635G、G3733A、G11696A及A1469

5、3G)的家系76個(gè)。 結(jié)論： 1.中國(guó)人群中LHON相關(guān)的原發(fā)突變發(fā)病頻譜較高加索人群有所差異，G3460A和T14484C突變所占比例較低。 2.對(duì)LHON家系3個(gè)原發(fā)突變所在片段篩查發(fā)現(xiàn)：同時(shí)攜帶原發(fā)突變G11778A和繼發(fā)突變的家系數(shù)量為27個(gè)，僅攜帶G11778A突變的家系148個(gè)，為下一步mtDNA全序列測(cè)定，是否存在中國(guó)人群特定繼發(fā)位點(diǎn)的研究提供了遺傳樣本基礎(chǔ)。 第二部分：線粒體DNA繼發(fā)突變

6、可能影響Leber遺傳性視神經(jīng)病變G11778A家系的表型表達(dá) 目的：選取一具有典型LHON癥狀、外顯率高的G11778A家系，對(duì)該家系先證者mtDNA全序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序，研究mtDNA繼發(fā)突變和單體型對(duì)G11778A突變所致LHON外顯率和表現(xiàn)度的影響。 材料與方法： 1.對(duì)一家系母系成員進(jìn)行眼科臨床檢查，詳細(xì)詢問(wèn)并記錄家族病史。 2.利用該家系先證者基因組DNA為模板，并設(shè)計(jì)包含mtDN

7、A全序的24對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序。 3.使用各種生物軟件(DNAStar、Chromas、SeqnConverter、ATCG、ClustalX)分析測(cè)序結(jié)果，分析所有的多態(tài)性位點(diǎn)、突變位點(diǎn)和保守性，分析mtDNA繼發(fā)突變和單體型對(duì)G11778A突變所致LHON外顯率和表現(xiàn)度的影響。 結(jié)果： 1.該家系具有典型LHON癥狀，母系成員共29位，其中19位患有不同程度的視力損傷，外顯率高(55。6％)；發(fā)

8、病年齡在8歲～30歲之間，平均發(fā)病年齡為18歲。 2.對(duì)該家系先證者mtDNA全序測(cè)序發(fā)現(xiàn)：攜帶原發(fā)突變G11778A和3個(gè)在不同物種進(jìn)化中編碼保守氨基酸的位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為CO1G6480A(V193I)、ND5T12811C(Y159H)及CytBA15395G(K217E)，以及其他多態(tài)性位點(diǎn)共45個(gè)突變；屬于東亞人群的mtDNA單體型M7b1’2。 3.三個(gè)重要突變G6480A、T12811C和A15395G在

9、正常對(duì)照中的頻率分別為1/191、4/191和1/191。 結(jié)論： 1.該家系具有典型的LHON癥狀，外顯率特別高(64.9％)，G11778A突變是其致病因素。 2.G6480A、T12811C和A15395G突變使得3個(gè)保守的氨基酸發(fā)生改變，分別為CO1(V193I)、ND5(Y159H)及CytB(K217E)，且同時(shí)在正常對(duì)照中出現(xiàn)，提示這3個(gè)突變不能致病，但能夠加劇由原發(fā)突變G11778A所致LHON的