戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗的構建及其免疫原性研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(HEV)為單鏈RNA病毒，無包膜，主要通過胃腸道傳播，引起急性戊型肝炎。戊型肝炎呈全球性分布，但主要累及發(fā)展中國家，是一種普遍流行、危害嚴重的疾病。HEV的廣泛存在，已經(jīng)成為一項關系公眾健康和社會穩(wěn)定的嚴重公共衛(wèi)生問題。因此，開發(fā)與研制戊型肝炎疫苗對阻止HEV的傳播及提高人口質量和衛(wèi)生保健水平有著深遠的意義。 由于HEV細胞培養(yǎng)尚不成功，目前主要研究HEV重組疫苗，ORF2及其編碼蛋白是目前研究最多的戊型肝炎候選疫

2、苗成分。由于HEV是一種經(jīng)胃腸道途徑傳播的病毒，因此通過口服等免疫誘導胃腸道局部粘膜免疫對抵抗HEV感染會有重要作用。本研究以減毒鼠傷寒沙門氏菌作為載體，采用來自南京地區(qū)戊型肝炎散發(fā)病例的第Ⅳ基因型毒株，選用其編碼ORF2蛋白中含HEV中和抗原表位的439-617位氨基酸(p179)片段的基因序列，將其與PYA3341質粒重組并轉化減毒鼠沙門氏菌χ4550，建立了能穩(wěn)定表達p179蛋白的戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗株。我們將此疫苗

3、株通過口服和鼻飼兩種不同途徑免疫小鼠，觀察其免疫效果。本實驗分為三個部分： 1南京地區(qū)戊型肝炎病毒基因型的鑒定及毒株的選擇 利用逆轉錄巢式聚合酶鏈反應(RT-nPCR)的方法檢測南京地區(qū)40份急性散發(fā)性戊型肝炎患者的糞便標本，將所獲得的PCR陽性產物進行測序。采用分子生物學軟件LASERGENE和PHYLIP軟件包進行序列的同源性比較、遺傳距離計算以及基因進化樹的繪制，利用生物信息學軟件比較核苷酸的同源性、遺傳距離，進行

4、基因分型。40份糞便標本中檢測到14份陽性HEVRNA，檢出率為35％，基因分型均為Ⅳ型HEV，說明南京地區(qū)散發(fā)性戊型肝炎均由Ⅳ型HEV引起，提示目前國內散發(fā)性戊型肝炎的病原主要為Ⅳ型HEV。因此我們選擇Ⅳ型HEV毒株ORF2蛋白中439-617位氨基酸(p179)片段進行構建戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗。 2戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗株的構建與鑒定 應用DNA重組技術構建了表達HEVORF2蛋白-p179

5、的減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗。用RT-PCR方法擴增HEVORF2編碼HEV中和抗原表位的基因片段，將其插入表達載體PYA3341中，構建重組質粒PYA3341-179，再將該重組質粒轉入鼠傷寒沙門氏菌疫苗株χ550，獲得重組菌株χ4550(PYA3341-179)。應用免疫印跡對重組菌所表達的重組蛋白進行免疫分析，其結果顯示該重組菌可表達重組ORF2蛋白，并且可以與病人血清和不同基因型HEV單克隆抗體發(fā)生免疫反應；該無抗藥性的雜合菌株

6、在體外營養(yǎng)選擇壓力下可較穩(wěn)定攜帶重組質粒傳代繁殖。用免疫劑量的重細細菌免疫BALB/c小鼠后，觀察一個月未見有異常現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)該菌株在體內也可較穩(wěn)定攜帶重組質粒傳代繁殖。表明戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌重組菌株χ4550(PYA3341-179)可用于戊型肝炎疫苗的研究。 3戊型肝炎重組候選疫苗株χ4550(PYA3341-179)的體液免疫學特性 將減毒鼠傷寒沙門氏菌χ4550和所構建的重組菌株χ4550(PYA334

7、1-179)以4×1011菌落形成單位(CFU)/只劑量，用口服和鼻飼兩種不同途徑免疫雌性BALB/c小鼠，分成4組，每組6只。分別采集免疫前以及免疫后的小鼠血清、糞便標本。用來自7種基因型和亞型HEVORF2C端p166多肽的重組蛋白混合物(p166Mix)和內毒素(LPS)作為抗原，檢測各組血清、糞便標本中特異性的IgG和IgA。結果表明，在血清標本中，存在抗p179蛋白和LPS特異性的IgG；而在小鼠糞便標本中測出抗上述兩種抗原的

8、特異性IgA。結果表明我們所構建的戊型肝炎減毒傷寒沙門氏菌重組菌株χ4550(PYA3341-179)免疫小鼠后，能夠誘導HEV特異性的IgG和IgA。 綜上所述，我們通過對南京地區(qū)HEV的基因型的鑒定，選取了HEVⅣ型毒株ORF2蛋白中439-617位氨基酸(p179)片段進行構建戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗株;所構建的重細疫苗株χ4550(PYA3341-179)在體外能夠與不同病人血清和不同基因型HEV單克隆抗體發(fā)生