五指山豬近交系矮小性分子遺傳基礎(chǔ)研究.pdf

1、五指山豬(Wuzhishang pig,WZSP)是我國(guó)著名珍稀豬種,是原產(chǎn)于海南島中南部山區(qū)的一個(gè)瀕臨滅絕的地方豬種,成年體重僅30-35kg,僅為正常豬種體重的15-30﹪,而且具有抗逆性強(qiáng)、性成熟早、肉質(zhì)好、遺傳穩(wěn)定等特性,經(jīng)近20年來的異地保種、實(shí)驗(yàn)化近交繁育,目前己培育成近交系群體并已獲得Fis個(gè)體(近交系數(shù)高達(dá)0.979).由于其在解剖學(xué)、生理學(xué)特性、營(yíng)養(yǎng)代謝等方面與人類極為相似,已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用,己成為研究人

2、類疾病理想的動(dòng)物模型,并列為我國(guó)異種器官移植、組織工程和"國(guó)家實(shí)驗(yàn)用小型豬種質(zhì)資源保存和開發(fā)中心"首選種豬.本研究以純種近交16代WZSP為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸相關(guān)基因進(jìn)行了一系列分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究,旨在探討WZSP近交系矮小的分子機(jī)理,并為其成為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供科學(xué)的理論依據(jù). 1)采用Elisa方法檢測(cè)了三月齡的大白豬和WZSP近交系的血清GH和IGF-I含量,比較發(fā)現(xiàn):WZSP近交系血清GH濃度略低于大白豬,但

3、二者之間差異不顯著(P>0.05);而WZSP近交系血清IGF-I濃度顯著低于大白豬(P<0.05),其中WZSP近交系母豬血清IGF-I濃度顯著低于大白豬母豬(P<0.05). 2)克隆得到WZSP近交系GH全長(zhǎng)cDNA(己登錄GenBank,登錄號(hào)為DQ415717),預(yù)測(cè)其編碼蛋白包括216個(gè)氨基酸,分子量為24.4Kda,等電點(diǎn)為7.175.WZSP近交系GH基因編碼區(qū)推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列與普通豬GH基因(GenBank

4、登錄號(hào):X53325)推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn):9號(hào)位置WZSP近交系發(fā)生氨基酸替換,纈氨酸替換丙氨酸(A-V),22號(hào)位置WZSP近交系發(fā)生氨基酸替換,谷氨酰胺替換精氨酸(R-0).但這兩處氨基酸替換均位于信號(hào)肽編碼區(qū),對(duì)GH的成熟肽沒有影響. 3)克隆得到WZSP近交系GHR.基因,其編碼區(qū)長(zhǎng)1917bp(已登錄GenBank,登錄號(hào)為DQ422962),該編碼區(qū)編碼一個(gè)擁有638個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),其分子量為71.1

5、Kda,等電點(diǎn)為4.509,是一個(gè)偏酸性蛋白質(zhì).WZSP近交系GHR基因編碼區(qū)推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列與普通豬GHR基因(GenBank登錄號(hào):NM214254.)推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)WZSP近交系GHR基因胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域存在五處氨基酸替換,可能會(huì)影響到WZSP近交系GHR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);而比對(duì)大白豬的GHR基因編碼區(qū)推導(dǎo)蛋白氨基酸序列與WZSP近交系GHR發(fā)現(xiàn):GHR胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域均存在兩處氨基酸替換,與己發(fā)現(xiàn)的人GHR基

6、因突變不盡相同,但是其中165號(hào)位置的氨基酸替換位于GHR的FN3保守結(jié)構(gòu)域中,推測(cè)該氨基酸替換可能對(duì)GHR的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響. 4)克隆得到WZSP近交系IGF-I基因大小為525bp,包含編碼區(qū)393bp.該編碼區(qū)僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義突變,未引起所編碼氨基酸的變化.該基因的編碼區(qū)編碼一個(gè)130個(gè)氨基酸的IGF-I前體蛋白,分子量為14.4Kda,等電點(diǎn)為9.144,是一個(gè)偏堿性蛋白. 5)構(gòu)建了WZSP近交系GH和

7、GHR基因原核表達(dá)載體,并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),WZSP近交系GH基因得到正確表達(dá),在目的分子量處出現(xiàn)特異性條帶,經(jīng)軟件掃描,其含量約占菌液總蛋白的20﹪:WZSP近交系GHR.基因并沒有發(fā)現(xiàn)特異性條帶,推測(cè)可能是由于大腸桿菌的密碼子偏愛造成了該基因在原核生物中表達(dá)困難.6)構(gòu)建了WZSP近交系GH基因、大白豬和WZSP近交系GHR基因真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK-15 進(jìn)行表達(dá),采用相對(duì)定量RT-PCR方法檢測(cè)JAK2基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):