廣西沼澤型水牛細(xì)胞因子基因的克隆與序列分析——（IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12（p35、p40）、IL-18和TNF-α）.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)將本地沼澤型成年水牛外周血單核細(xì)胞(Peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)在刀豆素A(Concanavalin A，ConA)的刺激下體外培養(yǎng)，提取培養(yǎng)的單核細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增水牛白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、白

2、細(xì)胞介素-10(interleukin-10.IL-10)、白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)，并克隆到pMD18-T載體上，然后進(jìn)行測(cè)序。 序列分析顯示，克隆的IL-2 cDNA長(zhǎng)724bp．包括一個(gè)全長(zhǎng)為468bp的完整編碼區(qū)(ORF)．共編碼155個(gè)

3、氨基酸，分子量為17.5KDa。在核苷酸水平上與印度水牛、牛、綿羊、山羊、豬、狗、人和鼠的IL-2基因同源性為99.6％、98.5％、98.3％、97.4％、85.6％、78.4％、80.3％、65.2％；推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為98.7％、96.8％、96.2％、94.2％、72.9％、61.5％、64.9％、48.7％。 克隆的IL-4 cDNA長(zhǎng)469bp，包括一個(gè)全長(zhǎng)為408bp的完整編碼區(qū)(ORF)，共編碼135個(gè)氨基

4、酸，分子量為15.0KDa。在核苷酸水平上與印度河流型水牛、牛、綿羊、豬、馬、鼠和人的IL-4 cDNA同源性分別為98.8％、99.3％、94.1％、84.8％、80.6％、62.7％和75.2％；推導(dǎo)的氨基酸的同源性分別為96.3％、98.5％、90.4％、78.4％59.6％、39.0％和64.7％。 克隆的IL-5 cDNA序列，長(zhǎng)430bp，ORF為405bp，共編碼134個(gè)氨基酸，分子量為15.3KDa。經(jīng)與GenB

5、ank中牛、綿羊、豬和馬的IL-5 cDNA序列比較可知，所克隆的基因與它們的同源性分別為99.0％、96.5％、89.6％和89.1％。氨基酸的同源性分別為97.8％、96.2％、85.9％和86.7％。 克隆的水牛IL-10的完整編碼區(qū)cDNA序列，經(jīng)分析其開(kāi)放閱讀框架(ORF)長(zhǎng)為536bp，編碼178個(gè)氨基酸，分子量為22.4KDa。與GenBank中印度河流型水牛、牛、羊、豬、馬、人和鼠的IL-10 cDNA序列比較可

6、知，所克隆的IL-10基因與它們的同源性為99.6％、97.2％、93.6％、83.9％、89.0％、85.1％和75.8％。氨基酸的同源性為100％、93.3％、89.3％、79.5％、88.2％、80.9％和74.2％。 克隆的水牛IL-12 p35基因序列全長(zhǎng)694bp，含一個(gè)全長(zhǎng)為666bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼222個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子質(zhì)量為24.86kDa。與GenBank登錄的印度河流型水牛p35的核苷酸

7、同源性為99.7％，氨基酸同源性為98.6％，與牛、羊、豬、馬、人和鼠的核苷酸同源性為98.5％、97.7％、77.6％、85.3％、85.3％和70.0％，氨基酸同源性為97.3％、95.5％、68.5％、79.7％、81.1％和55.9％。克隆的水牛IL-12 p40基因序列全長(zhǎng)1013bp，含一個(gè)全長(zhǎng)為984bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼328個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子質(zhì)量為37.03 kDa。與GenBank登錄的印度河流型水牛

8、p40的核苷酸同源性為99.5％，氨基酸同源性為98.8％，與牛、羊、豬、人和鼠的核苷酸同源性為98.6％、97.4％、81.1％、87.7％和74.9％，氨基酸同源性為97.6％、96.0％、75.6％、83.8％和67.7％。 克隆的水牛IL-18基因序列全長(zhǎng)602bp，含一個(gè)全長(zhǎng)為582bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼193個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子質(zhì)量為22.18kDa。與GenBank登錄的印度河流型水牛IL-18的核苷

9、酸同源性為99.1％，氨基酸同源性為99.0％，與牛、綿羊、山羊、豬、馬、人和鼠的核苷酸同源性為99.3％、97.8％、97.1％、91.5％、91.6％、85.6％和67.7％，氨基酸同源性為98.5％、94.8％、94.3％、89.1％、、87.1％、77.8％和60.6％。 克隆的水牛TNF-α基因序列全長(zhǎng)715bp，含一個(gè)全長(zhǎng)為705bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼234個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子質(zhì)量為25.56kDa。與

10、GenBank登錄的印度河流型水牛TNF-α的核苷酸同源性為99.7％，氨基酸同源性為98.7％，與牛、綿羊、山羊、豬、人的核苷酸同源性為98.6％、95.6％、96.2％、84.0％和73.0％，氨基酸同源性為97.9％、91.5％、91.9％、80.7％和70.6％。 這些結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功克隆出水牛的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(p35、p40)、IL-18和TNF-α基因，為今后研究和利用水牛細(xì)胞