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1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文micrNAs在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)及其對(duì)毛細(xì)胞分化的作用研究姓名:王仙仁申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專(zhuān)業(yè):耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師:姜鴻彥20100520中山大學(xué)博士論文microRNAs在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程巾的差異表達(dá)及其對(duì)毛細(xì)胞分化的作用研究Mathl,Jagged2,p27鼬p1,F(xiàn)actin。掃描電鏡觀察分化前后細(xì)胞形態(tài)。從C57BL/6鼠肝臟中提取基因組DNA,擴(kuò)增包含miR183家族成員的PCR產(chǎn)物,并定向插入
2、腺病毒穿梭載體pAdTrackCMV。將經(jīng)pineI線性化的重組穿梭載體與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BJ5183,通過(guò)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdmiR182、pAdmiR183、pAdmiR96。將pAdmiR在人胚腎293細(xì)胞(HEK293)中包裝并擴(kuò)增出pAdmiR的重組腺病毒。從基因組DNA中擴(kuò)增預(yù)測(cè)靶基因3UTRPCR產(chǎn)物,定向插入pRLTK載體。用pAdTrackCMVmiR、pRLTKutr、p
3、GLetl共轉(zhuǎn)染COS2細(xì)胞,雙熒光素酶法檢測(cè)雙熒光強(qiáng)度。qRTPCR法檢測(cè)內(nèi)耳前體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后miR—182表達(dá),轉(zhuǎn)染miR182重組腺病毒、miR182抑制劑,觀察其對(duì)內(nèi)耳前體干細(xì)胞分化的影響,熒光免疫法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Tbxl表達(dá)量。研究結(jié)果:miRNA芯片檢測(cè)了560個(gè)鼠miRNA,在耳蝸中有表達(dá)的有100多個(gè),與E135dpc內(nèi)耳表達(dá)的miRNA相比較,E165dpc有I/3表達(dá)量有變化,有56個(gè)miRNA表達(dá)差異在2倍以上
4、。miR140在耳泡形成期開(kāi)始表達(dá),先在kolliker器,Corti器,螺旋神經(jīng)節(jié),前庭上均有表達(dá),后特異性的表達(dá)在內(nèi)外毛細(xì)胞,前庭毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)上。qRTPCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)miR140在內(nèi)耳表達(dá)逐漸減少。miR182與miR140表達(dá)規(guī)律相似。耳泡體外分離培養(yǎng)3天后可以形成2種球,一種是實(shí)體球,一種空心球。RTPCR顯示未分化的球主要表達(dá)Abc92,nestin等干細(xì)胞Marker,分化后的球表達(dá)mathI,myosinIIVa
5、等毛細(xì)胞Marker。免疫熒光證實(shí),細(xì)胞球分化后表達(dá)mathl,myosinIIVa,細(xì)胞表面可見(jiàn)纖毛樣結(jié)構(gòu)。限制性?xún)?nèi)切酶分析和DNA測(cè)序結(jié)果顯示,重組腺病毒穿梭載體pAdTrackCMVmiR構(gòu)建正確,pRL—TKutr構(gòu)建正確。在HEK293細(xì)胞中成功包裝并擴(kuò)增出重組腺病毒rAdmiR183、rAdmiR一182、rAd—miR96。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)Tbxl是miR182的靶基因之一。內(nèi)耳前體干細(xì)胞增殖期miR—182表達(dá)量改
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