異源四倍體棉花遺傳圖譜的構(gòu)建與分子細胞遺傳學研究.pdf

1、利用加倍單倍體(DH)群體進行遺傳圖譜構(gòu)建，不但有利于圖譜的不斷加密，便于飽和圖譜構(gòu)建，而且其群體繁殖簡便易行，利于不同研究者間合作與交流，從而獲得更精確的結(jié)果。本實驗室曾利用具半配合特性的特殊材料vsg為母本，利用海島棉Hai7124和陸地棉TM-1雜交產(chǎn)生F<,1>作父本，創(chuàng)建棉花的一個DH永久性作圖群體，初步構(gòu)建四倍體栽培棉種的分子連鎖遺傳圖譜。但該圖譜的作圖群體只有58個植株，并且圖譜的標記數(shù)量及覆蓋度較飽和連鎖圖譜概念仍有一定

2、差距。因此，本研究在原有理論和方法基礎(chǔ)上，鑒定出新的單倍體并經(jīng)加倍獲得DH植株，構(gòu)建了一個包含73個植株的新的DH作圖群體，利用新開發(fā)出SSR引物進行圖譜的構(gòu)建。新圖譜含有444個SSR位點，組成40個連鎖群，標記位點間平均距離為7.35cM，覆蓋基因組3262.9cM遺傳距離。其中，29個連鎖群根據(jù)單、端體定位結(jié)果分別定位到19個染色體上(1-6，9-12，14-18，20，22，23，25和26)，10條連鎖群根據(jù)草棉和雷蒙德氏棉進

3、行的標記分析結(jié)果，分別定位到A、D基因組(LGA01、LGA02、LGA03、LGD02、LGD03以及LGD08)，一個連鎖群LGU01未被定位到任何染色體。 為了衡量不同作圖群體在棉花遺傳作圖中的效率，獲得更準確、可靠的圖譜數(shù)據(jù)，利用DH群體圖譜與利用相同親本Hai7124和TM-1及SSR標記構(gòu)建的一個回交群體圖譜進行了比較作圖分析。比較結(jié)果顯示，在大部分染色體或連鎖群上，兩個圖譜中共有標記都表現(xiàn)出了良好的共線性；在染色體

4、及基因組水平上分別對標記共線性上的差異分析顯示，與含有73個個體的DH群體相比較，含有140個個體的BCl群體由于具有更高的重組值估計能力，在不同染色體及基因組都具有較高的覆蓋度。這一結(jié)果為不同群體進行棉花遺傳圖譜的構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀以及棉種間圖譜的比較研究奠定了基礎(chǔ)。 近幾年，棉花分子遺傳圖譜構(gòu)建取得了巨大的進展，含有數(shù)千個分子標記的高密度圖譜業(yè)已成功構(gòu)建。但是，仍有六條連鎖群未能與具體染色體建立聯(lián)系，嚴重阻礙了棉花完整遺傳圖

5、譜的構(gòu)建。根據(jù)減數(shù)分裂熒光原位雜交(FIsH)結(jié)合易位雜合體材料的物理定位策略，我們利用連鎖群特異SSR標記篩選出連鎖群特異BAC克隆，成功將連鎖群進行了染色體的定位。在此，開發(fā)了一系列相關(guān)技術(shù)，其中多數(shù)屬國內(nèi)外首次報道： 首先，為了從一個棉花BAC文庫中篩選SSR標記的陽性克隆，我們開發(fā)了一種高通量的BAC-DNA提取方法，該方法利用了96深孔板和自動移液系統(tǒng)，實現(xiàn)在8h內(nèi)完成多達960個樣品DNA的提?。煌瑫r，建立了兩維法的

6、文庫篩選策略，并以SSR反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，建立了多引物PCR文庫篩選方法，利用該方法快速、準確地篩選到所需陽性克隆。其次，成功構(gòu)建了棉花有絲分裂中期和減數(shù)分裂中期I的細菌人工染色體原位雜交(BAC-FISH)技術(shù)體系，信號分析顯示該方法具有較高的檢出率及穩(wěn)定性。其中棉花有絲分裂染色體BAC-FISH技術(shù)屬國內(nèi)首次應(yīng)用，減數(shù)分裂的BAC-FISH技術(shù)為國際首次報道。 最終，在這一系列技術(shù)成功開發(fā)基礎(chǔ)上，我們利用遺傳圖中六條未定位到染

7、色體上的連鎖群上特異的SSR標記篩選一個以陸地棉材料TM-1構(gòu)建的BAC文庫，得到相應(yīng)連鎖群特異BAC克隆，并以之為探針與一套陸地棉的易位雜合體材料雜交，將這六條連鎖群A01，A02，A03，D02，D03及D08分別定位到染色體13，8，11，21，24和19上。國際上首次將四倍體棉遺傳圖譜連鎖群全部定位到相應(yīng)染色體上。并且，以四倍體棉13對部分同源染色體為基礎(chǔ)，提出了一種新的易于使用和交流四倍體棉染色體的命名方法，即A組染色體按照原

8、命名順序重新命名為A1至A13，而D組染色體按對應(yīng)A組染色體的部分同源關(guān)系依次命名為D1至D13。 染色體識別是基因組核型分析的基礎(chǔ)。由于棉花染色體數(shù)量大加之形態(tài)較短小，缺乏差異，常規(guī)的帶型等染色體識別方法無法應(yīng)用，使得其染色體的正確識別及進一步的核型研究工作難以實現(xiàn)。BAC-FISH技術(shù)在染色體的識別中顯現(xiàn)出了難以比擬的優(yōu)越特性，在前述連鎖群(染色體)特異BAC克隆開發(fā)基礎(chǔ)上，我們從一個棉花高密度遺傳圖譜上選擇各染色體特異SS

9、R標記，并篩選另一個以雄性不育恢復(fù)系材料0-613-2R構(gòu)建的BAC文庫，開發(fā)出一套完整的四倍體棉染色體特異BAC克隆，利用其BAC-FISH雜交信號作為染色體的特異細胞學標記，準確地識別出棉花26條染色體，這也是第一套關(guān)于多倍體植物物種染色體特異BAC克隆的報道。同時，BAC-FISH技術(shù)的應(yīng)用亦實現(xiàn)了物理圖譜與遺傳圖譜的比較作圖分析。本研究發(fā)現(xiàn)，在我們開發(fā)的這一套26個染色體特異克隆中，盡管部分標記在遺傳圖中位于連鎖群的中部，但相應(yīng)

10、克隆的原位雜交定位顯示，其位于染色體的末端或近末端處，暗示棉花基因組中染色體的遠端往往是重組活躍區(qū)段。另外，利用遺傳圖上末端標記的染色體物理定位分析，進行了遺傳圖譜飽和度的評估。對來自染色體A6上的兩個末端標記的陽性BACs 47N15和75F07進行了物理定位，結(jié)果顯示，它們位于染色體的末端，證明該連鎖群上的標記已基本覆蓋該染色體。 利用一個與雜種優(yōu)勢相關(guān)的EST序列的特異引物Y2232篩選文庫獲得陽性克隆36D03，并利用B

11、AC-FISH將其定位染色體A7長臂上，與遺傳圖譜定位結(jié)果一致。由于BAC插入片段通常為100kb左右，與直接利用較小的目的基因等序列片段進行原位雜交相比，信號更易識別，結(jié)果更為可靠，這亦為目的片段的物理定位提供了有力的工具及新的途徑。同時，我們對兩種不同類型、揭示部分同源關(guān)系的BAC克隆進行了FISH定位分析。結(jié)果暗示，SSR標記產(chǎn)生的兩個等位位點往往來自部分同源染色體。而另一發(fā)現(xiàn)顯示，雖然經(jīng)過長期的進化演變，四倍體棉部分同源染色體上