CML細胞的IFN-α反應(yīng)性表面標志多肽的作用研究.pdf

1、背景和目的:慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起始于骨髓多能干細胞惡性增殖性疾病，干擾素α(interferon-α，IFN-α)是治療CML最為有效藥物之一，但IFN-α的耐藥性限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。本課題組前期用噬菌體展示技術(shù)已篩選出能特異性地結(jié)合于對IFN-α敏感的CML細胞株KT-1/A3的肽配體:KLWVIPQ，本課題以KLWVIPQ七肽為研究對象，探索KLWVIPQ對IF

2、N-α識別和結(jié)合靶細胞的影響以及多肽的生物學(xué)效應(yīng)，為CML細胞對干擾素的耐藥性機制提供線索和實驗依據(jù)。
　　方法:本課題利用CML細胞株KT-1/A3和KT-1/A3R為靶細胞，構(gòu)建了pEGFP-多肽重組真核表達載體，同時化學(xué)合成了熒光標記的多肽。重組多肽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，通過Real Time-PCR檢測P53 mRNA表達水平、WST-1試劑盒檢測細胞存活率、caspase3試劑盒檢測caspase3酶活性以及流式細胞術(shù)檢測細胞

3、凋亡和周期;化學(xué)合成多肽直接誘導(dǎo)培養(yǎng)KT-1/A3和KT-1/A3R細胞后通過細胞計數(shù)、WST-1試劑盒檢測細胞存活率、Western blotting檢測P53和P210的表達水平等方法綜合分析多肽KLWVIPQ對KT-1/A3和KT-1/A3R細胞的影響。
　　結(jié)果:Real Time-PCR分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細胞P53 mRNA表達增高，與對照組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/

4、A3細胞組相比，轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細胞中再加入IFN-α后P53的mRNA表達水平降低。WST-1和流式細胞術(shù)檢測得出相似的結(jié)果，轉(zhuǎn)染了重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細胞存活率降低，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的KT-1/A3細胞中加入IFN-α后細胞存活率升高。caspase3酶活性檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細胞caspase3酶活性升高，與對照組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但轉(zhuǎn)染重組多肽質(zhì)粒的KT-1/A3細胞和轉(zhuǎn)染了p

5、EGFP空質(zhì)粒的KT-1/A3細胞各加入IFN-α后，兩者之間差異顯著。當KT-1/A3細胞中加入化學(xué)合成多肽0.01μg/mL時，通過細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)KT-1/A3細胞存活率降低，與對照組之間具有顯著性差異，當加入多肽后再加入IFN-α，細胞活性率上升;用WST-1檢測得出相似的結(jié)果，為了進一步驗證，通過Western blotting實驗發(fā)現(xiàn)IFN-α和多肽都能誘導(dǎo)P53蛋白質(zhì)的表達，同時降低P210的表達量，當兩者同時使用時多肽和IF