熱休克蛋白90抑制劑17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素增強熱誘導骨肉瘤細胞殺傷的研究.pdf

1、腫瘤熱療是觸發(fā)細胞死亡與保護機制的典型應激刺激，二者的相互作用決定了熱療細胞的命運：死亡或者幸存。熱休克蛋白家族成員中的分子量為90kD的熱休克蛋白(HSP90)是真核細胞中最豐富、最活躍的伴侶蛋白之一。它在細胞發(fā)生應激反應時（如熱休克），可以和那些由于環(huán)境刺激而使自身構象發(fā)生改變的蛋白相互作用，保證蛋白進行適當?shù)恼郫B并防止蛋白非特異性聚集，從而維持細胞的正?；钚?。HSP90還參與甾體激素受體、轉錄因子、信號途徑和翻譯起始階段的激酶及一

2、氧化氮合酶的成熟、胞內轉運和活性調節(jié)。HSP90作為分子伴侶，其已確定的客戶蛋白超過100個，許多客戶蛋白是細胞增殖信號通路中的重要分子，與腫瘤密切相關。因而以它作為靶標的靶向治療具有較大的研究價值。
　　17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素(17AAG)是一種苯醌安沙霉素抗生素格爾德霉素(GA)的衍生物，它能與HSP90結合，促使HSP90所伴隨的對腫瘤細胞的增殖和存活起重要作用的蛋白發(fā)生降解，而具有顯著的抗腫瘤活性。
　

3、　骨肉瘤是兒童和青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤。20世紀70年代以前，主要治療方法是截肢和關節(jié)離斷，5年生存率<25％，隨著外科技術和影像學的發(fā)展，新輔助化療、放療、免疫治療、熱療等多種治療手段的綜合應用，骨肉瘤治愈率有了改進，5年生存率達到80％。但目前的治療手段仍無法解決腫瘤病人的轉移、復發(fā)和藥物耐藥等情況，因此，尋求新的抗癌靶點有望為骨肉瘤的治療開辟一條新的途徑。為了研究HSP90抑制劑17AAG對骨肉瘤細胞的生物學作用及其對骨肉

4、瘤細胞熱誘導殺傷效應的影響并探討其可能涉及的作用機制，本文完成了下列研究工作:
　　1.17AAG對骨肉瘤SOSP-9607細胞的生物學作用
　　采用四唑鹽比色實驗(MTT)法觀察到17AAG明顯抑制骨肉瘤SOSP-9607細胞的生長，呈劑量、時間依賴性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.548μM;進一步采用AnnexinV-FITC染色流式細胞術(FCM)、吖啶醇熒光染色等方法觀察到17AAG誘導骨肉瘤SOSP-9607細胞

5、凋亡，呈劑量依賴性。
　　2.17AAG對熱誘導骨肉瘤SOSP-9607細胞殺傷效應的影響
　　采用鹽比色實驗觀察到加熱與17AAG對骨肉瘤SOSP-9607細胞作用間有協(xié)同作用，加熱聯(lián)合17AAG治療組明顯增強了單獨加熱對骨肉瘤SOSP-9607細胞的殺傷效應(P＜0.01)；干細胞集落形成實驗也顯示加熱聯(lián)合17AAG治療組較單獨加熱對骨肉瘤SOSP-9607細胞的殺傷效應明顯增強(P＜0.05)；AnnexinV-FIT

6、C染色流式細胞術結果顯示熱療聯(lián)合17AAG治療組所致凋亡率（52.2％）大于單純加熱組（17.5％）；且用吖啶橙熒光染色法觀察到加熱聯(lián)合17AAG治療組出現(xiàn)明顯骨肉瘤SOSP-9607細胞固縮，著色不均而且較深，細胞核濃縮、裂解等凋亡特征。
　　3.17AAG單獨或聯(lián)合加熱對MAPK信號轉導通路的影響
　　通過蛋白免疫印跡分析觀察到單獨加熱組磷酸化AKT及磷酸化Raf-1的水平并沒有改變甚至有輕微增加，而應用17AAG聯(lián)合加

7、熱組磷酸化AKT及磷酸化Raf-1的水平顯著降低。該結果提示17AAG可能通過阻止MAPK信號通路中Erk支路與PI3K-AKT通路的信號轉導途徑增強熱誘導骨肉瘤SOSP-9607細胞的殺傷效應。
　　綜上所述，本研究證實了17AAG能抑制骨肉瘤細胞生長，誘導骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡，為17AAG應用于骨肉瘤化療提供了實驗依據(jù)。將HSP90分子伴侶復合物阻止劑17AAG應用于骨肉瘤SOSP-9607細胞熱療具有顯著熱療增敏效應;其機制可