蘋果逆轉(zhuǎn)座子atr1及基于atr1-LTR的元帥系短枝變異品種中特異性位點的分離.pdf

1、蘋果芽變的頻率高，芽變在其育種工作中發(fā)揮巨大的作用，目前生產(chǎn)上廣泛種植的許多優(yōu)良品種和品系都是通過芽變育種獲得的。短枝變異為芽變類型的一種。前期研究結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)座子atr1參與了蘋果的短枝變異，并利用反向PCR獲得了atr1的3'-LTR和RT等部分酶區(qū)序列;基于atr1-LTR的IRAP和染色體步移法在“元帥”四個短枝變異品種“玫瑰紅”、“矮紅”、“奧勒岡矮生”和“華帥一號”均獲得了一約1722 bp的特異性擴增條帶。本研究在此基礎上

2、，利用逆轉(zhuǎn)座子atr1序列特征和染色體步移法獲得了atr1全長，序列分析結(jié)果表明atr1為一典型的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子。利用染色體步移法擴增四個短枝變異品種“玫瑰紅”、“矮紅”、“奧勒岡矮生”和“華帥一號”中特異片段的側(cè)翼序列，在四個短枝變異品種中均獲得一長度為4345 bp的特異片段，序列比對分析發(fā)現(xiàn)四個短枝變異品種中的特異性片段相同，提交蘋果基因組網(wǎng)站分析，結(jié)果暗示此特異序列可能是逆轉(zhuǎn)座子攜帶其旁側(cè)序列轉(zhuǎn)座插入到新位點所致。

3、
　　1.逆轉(zhuǎn)座子atr1全長的分離
　　1.1利用逆轉(zhuǎn)座子序列特征分離逆轉(zhuǎn)座子atr1
　　在前期獲得atr1-3'-LTR、RT以及部分3'端旁側(cè)序列2124bp基礎上，根據(jù)Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的序列結(jié)構(gòu)特征，依據(jù)3'-LTR設計正向引物，根據(jù)5'-RT序列設計反向引物，進行巢氏PCR，獲得atr1大部分序列，僅缺少5'-LTR的5'端少數(shù)堿基。
　　1.2利用反向PCR分離atr1的5'-LTR及其

4、5'端側(cè)翼序列
　　利用限制性內(nèi)切酶VspⅠ酶切玫瑰紅基因組DNA，T4連接酶將酶切片段自連環(huán)化作為PCR模板，進行巢氏PCR，得到逆轉(zhuǎn)座子atr1的5'-LTR及其側(cè)翼序列。
　　1.3逆轉(zhuǎn)座子atr1全長的驗證及其在蘋果基因組的分布
　　利用拼接所得逆轉(zhuǎn)座子atr1-5'端旁側(cè)序列設計正向引物，3'端LTR序列加接頭設計反向引物，進行巢氏PCR，得到序列長度為4996 bp的逆轉(zhuǎn)座子atr1全長。經(jīng)分析，atr1為

5、典型的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子，包含了“5'-LTR，GAG區(qū)，INT區(qū)，RT區(qū)，RNaseH區(qū)和3'-LTR”。
　　將atr1提交蘋果基因組網(wǎng)站進行比對，發(fā)現(xiàn)其在蘋果基因組內(nèi)同源序列較多，表明該逆轉(zhuǎn)座子具有轉(zhuǎn)座活性且參與了蘋果基因組的進化。選擇與atr1相似度最高的10條序列進行比對，分析發(fā)現(xiàn)一酶區(qū)與atr1功能區(qū)相似性高達96.4％的序列“MDC018640.562”的側(cè)翼各有5bp的插入位點(AGACA)，但其LTR與

6、atr1相似度僅為65.24％。而與atr1酶區(qū)及LTR相似度都很高的逆轉(zhuǎn)座子側(cè)翼都沒有插入位點序列。
　　2.“元帥”系四個短枝變異品種“玫瑰紅”、“矮紅”、“奧勒岡矮生”和“華帥一號”中特異性位點的分離
　　2.1利用TAIL-PCR分離四個短枝變異品種中特異片段1722 bp的5'-端旁鄰序列
　　利用已獲得的4個短枝變異品種中特異性擴增片段1722 bp設計引物，借助TAIL-PCR方法分離1722 bp的5'

7、-端旁鄰序列，所得序列與1722 bp拼接并驗證后獲得一1964 bp的片段。分析結(jié)果顯示四個短枝變異品種中1964 bp相同，PCR檢測結(jié)果表明1964 bp為“元帥”系四個短枝變異品種中特異性擴增條帶。
　　2.2借助蘋果基因組序列分離四個短枝變異品種中特異片段1722 bp的3'-端側(cè)翼序列
　　將1722bp提交蘋果基因組比對，發(fā)現(xiàn)3'-端1148 bp在蘋果基因組中存在多條相似度高達90％以上的序列。將這些序列分析

8、后選出一段共同系列，與1722 bp的3'端拼接，在1722 bp的5'端270 bp處設計上游引物進行驗證，分離一長度為2271 bp的序列，新分離的3'-端序列長度為859 bp。分析結(jié)果顯示四個短枝變異品種中2271 bp相同，PCR檢測結(jié)果表明2271 bp為“元帥”系四個短枝變異品種中特異性擴增條帶。
　　2.3利用hiTAIL-PCR分離四個短枝變異品種中特異片段1964 bp的3'-端側(cè)翼序列
　　利用已獲得的

9、四個短枝變異品種中特異性擴增片段1964 bp設計引物，借助HiTAIL-PCR方法分離1964 bp的3'-端旁鄰序列，所得序列與1964 bp拼接并驗證后獲得一3032 bp的片段，新分離的3'-端序列長度為1010 bp。分析結(jié)果顯示四個短枝變異品種中3032 bp相同，PCR檢測結(jié)果表明3032 bp為“元帥”系四個短枝變異品種中特異性擴增條帶。
　　2.4利用反向PCR分離四個短枝變異品種中特異片段3032 bp的5'-