維甲酸致昆明小鼠腭裂發(fā)生過程中RARα、Dishevelled2、Vangl2和β-catenin蛋白表達狀況的實驗研究.pdf

1、目的： 腭裂是一種發(fā)病率較高并為人們關(guān)注的一種先天性頜面部發(fā)育缺陷，一般認為，病因為基因和環(huán)境因素的聯(lián)合作用。腭的形成是一個極其復(fù)雜生物學(xué)過程，受到諸多基因的嚴密調(diào)控，其中任何相關(guān)基因的表達異常，都可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。RA是維生素A在體內(nèi)的自然活性代謝物，也是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的形態(tài)發(fā)生素。在小鼠腭組織發(fā)育敏感期，RA可誘發(fā)子代發(fā)生腭裂。在腭裂發(fā)生過程中PARα起關(guān)鍵作用，RA可以通過調(diào)節(jié)PARα在鼠胚繼發(fā)腭中的表達參與腭的

2、形態(tài)發(fā)生。Wnt蛋白是一類由Wnt基因編碼的分泌型糖蛋白，通過與細胞膜上相關(guān)受體和蛋白相互作用啟動Wnt信號傳導(dǎo)，與胚胎發(fā)育及器官形成等密切相關(guān)。β-catenin是經(jīng)典wnt信號途徑中不可缺少的關(guān)鍵性效應(yīng)分子，參與顱面部形態(tài)發(fā)生等一系列生物學(xué)過程，其表達失調(diào)可致顱面部發(fā)育缺陷和面部模式形成障礙。Dishevelled蛋白是胞質(zhì)內(nèi)多條Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的銜接子，Vang12蛋白也是該信號通路中不可缺少的關(guān)鍵分子成員，與許多其他相關(guān)基因的

3、蛋白質(zhì)產(chǎn)物共同構(gòu)成一條極為復(fù)雜的控制胚胎發(fā)育、細胞命運及組織器官形態(tài)發(fā)生的細胞信號通路，其異常激活將導(dǎo)致各種先天畸形。 本研究以昆明小鼠為研究對象，建立RA致小鼠腭裂畸形動物模型，以改動物模型為研究對象，利用免疫組化法初步探討PAR α受體、Dishevelled2、β-catenJn和Vang12蛋白在RA致胚胎腭裂畸形發(fā)生中的表達狀況和變化規(guī)律，以期闡明過量RA致腭裂的發(fā)生機制，為腭裂的預(yù)防與治療提供實驗依據(jù)。實驗方法1.R

4、A致昆明小鼠腭裂畸形動物模型的建立：下午六點昆明小鼠雌雄2:1合籠，次日早上陰栓陽性雌鼠定為孕0d天。孕鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組分別于孕10d一次性灌服60、80、100 mg/kg RA。以確定給藥劑量；分別于孕8、12 d給予80mg/kg RA，以確定給藥時間。對照組于相同時間一次性灌服等量芝麻油。GDl6d脫頸處死，剖宮取胎鼠，解剖顯微鏡下觀察腭裂發(fā)生情況，部分樣本常規(guī)制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察腭裂形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

5、 2.RARα、Dishevelled2，、β-catenin和’Vang12蛋白檢測：實驗組和對照組孕鼠各隨機分為8小組，分別于GD138、GD1314、GD1322、GD148、GD1414、GD1422、GD158和GD15228個時間點剖宮取胚鼠，常規(guī)石蠟切片。采用SP免疫組織化學(xué)法檢測PAR Q、β-catenin、Di shevelled2和Vang12蛋白在各組不同時期腭板上皮和間充質(zhì)的表達和分布狀況。 實

6、驗結(jié)果 1.動物模型建立在孕10d給予80mg/kg劑量RA誘導(dǎo)昆明小鼠腭裂發(fā)生率最高為100％(28/28)，為理想腭裂動物模型2.RAR α、Dishevelled2、Vang12及β-catenin蛋白表達結(jié)果(1)RARα蛋白表達對照組：在腭板上皮中PARα的表達呈現(xiàn)先逐漸上升(GD138～GD148)，而后逐漸下降(GD148～GD1422)，之后再次上升(GD1422～GD1522)的趨勢，峰值出現(xiàn)于GD148時。間

7、充質(zhì)中的表達趨勢與其在腭板上皮中的表達趨勢相仿，但表達水平卻明顯低于上皮。 實驗組：腭板上皮中PARα的表達，與對照組相比，于GD1522時有一個大幅下降的過程，于GD1314～GD148時明顯低于相應(yīng)對照組(P<0.01)，并于GD1522時再次降至明顯低于對照組的水平(P<0.01)。在腭板間充質(zhì)，除GD1422外，各時間段實驗組的表達水平均低于相應(yīng)對照組，以GD1322、GD148、與GD1522更為顯著(P<0.01)。

8、 (2)Dishevelled2蛋白表達對照組：Dishevel1ed2蛋白在腭板上皮的表達水平明顯強于其在相應(yīng)時期間充質(zhì)中的表達(P<0.01，P<0.05)。在腭板上皮，呈現(xiàn)先逐漸上升(GDl38～GDl322。)，而后逐漸下降(GD1322～GD1414)，之后再次上升(GD1414～GD1522)的趨勢，峰值出現(xiàn)于GD1322時，谷值出現(xiàn)于GD1414時。在間充質(zhì)的表達趨勢與腭板上皮大體相仿，但于GD1414時有一個大幅

9、下降的過程。 實驗組：Dishevelled2蛋白在間充質(zhì)的表達趨勢與對照組大體相仿，但于GDl5。時有一個大幅上升的過程。于GD138～GD1314時明顯高于相應(yīng)對照組，(P<0.05)，但于GD158時再次上升至明顯高于對照組的水平(P<0.01)。腭板上皮Dishevelled2蛋白表達與其在間充質(zhì)中表達基本一致。 (3)Vang12蛋白表達結(jié)果對照組：在各組腭板上皮和間充質(zhì)均有不同程度的表達，呈棕黃色的陽性著色，

10、上皮中的表達明顯高于其在同時期的間充質(zhì)(P<0.01，P<0.05)。間充質(zhì)中表達呈現(xiàn)，先逐漸上升(GD138～GD1322)，后逐漸下降(GD1322～GD1422)，之后再次上升(GD1422～GD1522)的趨勢。在上皮中的表達時高時低呈波浪狀，無明顯規(guī)律。 實驗組：在腭板間充質(zhì)中，GD138～GD148階段，Vang12蛋白表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。GD1414～GD1522時期，則僅在GD1414

11、和GD158兩個時段降至低于相應(yīng)對照組的水平。在實驗組腭板上皮，Yang12表達也呈現(xiàn)波浪狀，實驗組和對照組表達水平消長互現(xiàn)，無明顯規(guī)律性。 (4)β-catenin蛋白表達結(jié)果對照組：在腭板上皮中的表達量先逐漸下降(GD138～GD1414)，而后突然上升(GD1414)，之后又逐漸下降(GD1422～GD1522)。峰值出現(xiàn)于GD1414，谷值出現(xiàn)于GD148。其在腭板間充質(zhì)中的表達水平均明顯低于其在上皮細胞中的表達水平。

12、 實驗組：在腭板上皮，其表達量則呈現(xiàn)波浪狀發(fā)展趨勢，除GD1414明顯低于對照組(P<0.01)，GD158時無顯著差異外，其它時間點的表達均顯著增高(P<0.01)。在腭板間充質(zhì)，其表達水平波動在一個很小的范圍內(nèi)(0.373～0.454)，無明顯規(guī)律。 結(jié)論： 1于孕10d灌服80mg/kgRA誘導(dǎo)昆明小鼠腭裂是一種有效動物實驗?zāi)Ｐ汀?2.RARα、Dishevelled2、Vang12及β-cateni