鈉泵α2亞基M4-M5區(qū)的克隆、表達及單抗的制備與鑒定.pdf

1、Na+,K+-ATPase,又稱鈉泵,是高等真核生物細胞膜上普遍存在的一種特殊的膜結(jié)合蛋白,它在維持體內(nèi)滲透壓的平衡、穩(wěn)定細胞膜電位、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有重要作用。Na+,K+-ATPase是由α和β亞單位組成的異源二聚體,其中α亞單位是催化亞單位,它貫穿嵌入膜中,有10個跨膜區(qū)(M1～M10),具有酶的活性和許多鈉泵調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點,其中M4～M5區(qū)直接參與了ATP的催化水解。鈉泵α亞基有α1、α2、α3、α4四種亞型,各異構(gòu)體間功能

2、各異,具有種屬特異性,近期的研究表明,鈉泵α2亞基與高血壓的發(fā)生和發(fā)展具有很大關(guān)系。本研究擬構(gòu)建鈉泵α2亞基M4～M5膜內(nèi)區(qū)蛋白BB4-5的原核表達體系,表達并純化目的蛋白,制備Na+-K+-ATPaseα2亞基的單克隆抗體,為進一步研究鈉泵α2亞基在體內(nèi)的作用機制,及與疾病發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 一、鈉泵α2亞基M4-M5區(qū)蛋白的克隆和表達
　　 目的:利用基因重組技術(shù)構(gòu)建鈉泵α2亞基M4-M5膜內(nèi)區(qū)蛋白的表達載體

3、,IPTG誘導(dǎo)表達獲得蛋白,通過蛋白純化技術(shù)將蛋白純化,為鈉泵α2亞基單抗制備提供抗原。
　　 方法:(1)鈉泵α2亞基M4-M5克隆載體的構(gòu)建。以質(zhì)粒YhNα2(含人鈉泵α2亞基cDNA序列)為模板,PCR擴增得到α2亞基M4-M5區(qū)的基因片段BB4-5,將其加尾后連接至克隆載體pGM-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽性克隆,得到質(zhì)粒PGMT-BB4-5。(2)鈉泵α2亞基M4-M5蛋白表達體系的構(gòu)建。從質(zhì)粒PGMT-BB4-

4、5上切下目的基因片段,雙酶切連接到表達載體pET28b(+)上并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta2,挑選陽性克隆,得到質(zhì)粒pET28b(+)-BB4-5。雙酶切驗證目的基因序列是否正確。1％接種表達菌,用終濃度為0.4 mM的IPTG進行誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達。(3)重組蛋白的純化:將菌體破碎,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白存在的形式,將包涵體變性和復(fù)性后,用Ni-NTA親和柱進行純化,檢測目的蛋白的純度。(4)重組

5、蛋白的Western blotting分析:將Ni2+親和層析純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后,電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,封閉,加入鈉泵α2亞基抗血清或抗His抗體,洗膜,DAB顯色試劑盒進行顯色,凝膠成像儀照相。
　　 結(jié)果:(1)以質(zhì)粒YhNα2為模板進行PCR擴增得到基因片段BB4-5,產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測,在相應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯的條帶。將其加尾后連接至pGM-T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α,挑選陽性克隆

6、擴增并提取質(zhì)粒,雙酶切和測序結(jié)果顯示基因序列與理論一致。(2)將目的基因片段與同樣雙酶切的PET28b(+)表達載體相連,轉(zhuǎn)化Rosetta2感受態(tài)細胞,在含Kan的平板上篩選重組子。雙酶切結(jié)果表明蛋白表達體系構(gòu)建成功。用IPTG誘導(dǎo)表達后,SDS-PAGE結(jié)果表明,BB4-5目的條帶與理論值一致。(3)菌體破碎后,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明,表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在,將包涵體用鹽酸胍變性,梯度稀釋復(fù)性后,用Ni-NTA親和柱進

7、行純化,得到純度在90％以上的目的蛋白。(4)表達產(chǎn)物BB4-5經(jīng)Western blotting分析,可與鈉泵α2亞基的抗體及抗His抗體特異性結(jié)合.
　　 結(jié)論:本研究成功的構(gòu)建了鈉泵α2亞基M4-M5蛋白表達載體pET28b(+)-BB4-5,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,Ni-NTA親和柱進行純化,得到純度在90％以上的目的蛋白,可作為抗原來制備鈉泵α2亞基單抗。
　　 二、鈉泵α2亞基單抗的制備與鑒定
　　 目的

8、:以鈉泵α2亞基M4-M5膜內(nèi)區(qū)重組蛋白為抗原,免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體,并采用ELISA間接法和免疫印跡對單克隆抗體的特性進行和鑒定,為探明鈉泵α2亞基在體內(nèi)的作用機制,及其與疾病發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)將α2亞基純化蛋白作為抗原,免疫6～8周BALB/c小鼠。(2)通過雜交瘤技術(shù)來篩選α2亞基的單克隆抗體:取被免疫動物的脾細胞(B淋巴細胞),與Sp2/O骨髓瘤細胞雜交;用間接ELIS

9、A法篩選陽性(抗體分泌)細胞;將陽性細胞通過有限稀釋法進行克隆化,直接獲得可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系,建株。(3)以小鼠腹水法制備雜交瘤的粗制單克隆抗體,采用辛酸-硫酸銨沉淀法將抗體進行純化。(4)采用Sigma公司小鼠mAb Ig亞類檢測試劑盒檢測抗體的亞型。(5)采用Western-blotting法檢測抗體的特異性。(6)參照Beatty的方法,采用間接ELISA法測定抗體的親和常數(shù)。
　　 結(jié)果:(1)6～8周B

10、ALB/c小鼠免疫后,測得小鼠血清抗體效價均為1:50000以上。(2)選取抗體效價較高的小鼠分離脾細胞,采用常規(guī)方法與Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合,通過多次間接ELISA實驗進行篩選,檢測出陽性孔有14孔,克隆化后得到兩株效價較高細胞株。(3)小鼠腹腔接種雜交瘤細胞株,收集腹水,通過辛酸-硫酸銨沉淀法進行純化,得到純化的mAb。(4)通過小鼠mAb Ig亞類檢測試劑盒檢測兩株mAb的亞型均為IgG2a。(5)Western-blott