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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
采用不同濃度的檳榔堿處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞,觀察它對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響,并初步探討其機(jī)制。
方法:
(1)采用MTT(噻唑藍(lán), Methylthiazolyl tetrazolium)法檢測(cè)檳榔堿對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
(2)用傳統(tǒng)的“雞尾酒”法(即含胰島素、地塞米松和異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl methyl xanthine, IBMX)的混合誘導(dǎo)劑)將3T
2、3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化,在誘導(dǎo)分化的第0天用或不用100μmol/L檳榔堿處理72h,于誘導(dǎo)分化的第9~11天,用油紅O染色,觀察拍照,并用異丙醇提取脂質(zhì)吸附的油紅O染料,測(cè)定OD值以定量脂質(zhì)含量。
(3)在誘導(dǎo)分化第3天和第11天,提取細(xì)胞的總RNA,RT-PCR檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá),包括誘導(dǎo)分化早期基因 Pref-1(前脂肪細(xì)胞因子, preadipocyte factor1,)、C/EBPα和C
3、/EBPβ(CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α和β, CCAAT-enhancer binding protein-alpha and beta),脂肪生成相關(guān)基因Fas(脂肪酸合成酶, fatty acid synthase,)、adrp(脂肪分化相關(guān)蛋白, adipose differentiation-related protein/adipophilin)和plin(圍脂滴蛋白, perilipin),誘導(dǎo)分化成熟標(biāo)志基因PPARγ2(
4、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體, peroxisome proliferator-activated receptor gamma2)、Glut4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4, glucose transporter type4)。
結(jié)果:
(1)檳榔堿對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性。在0-800μmol/L濃度范圍內(nèi)細(xì)胞相對(duì)存活率隨濃度增大而明顯降低,具有濃度依賴性。100μmol/L檳榔堿處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞2
5、4h、48h、72h和96h,細(xì)胞存活率之間無(wú)明顯差異,約為70%。當(dāng)檳榔堿濃度≥200μmol/L時(shí),檳榔堿處理48h、72h、96h細(xì)胞存活率均顯著低于24h,均小于20%,而48h、72h和96h之間的細(xì)胞活性無(wú)顯著性差異。
(2)油紅O染色顯示檳榔堿處理組(Are,100μmol/L Arecoline)中含有“戒環(huán)”樣脂滴成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)目明顯少于對(duì)照組(Control,0μmol/L Arecoline)。脂肪細(xì)胞
6、脂質(zhì)含量定量結(jié)果顯示:檳榔堿處理組脂質(zhì)含量較對(duì)照組減少24.2%。
(3)100μmol/L檳榔堿對(duì)前脂肪細(xì)胞因子Pref-1基因表達(dá)無(wú)顯著影響,但可顯著降低誘導(dǎo)分化第3天和11天的C/EBPα和C/EBPβ基因表達(dá)。在誘導(dǎo)分化第3天和第11天,與對(duì)照組相比,檳榔堿處理組C/EBPα基因表達(dá)水平分別降低10.7%和7.6%;而C/EBPβ基因表達(dá)水平分別降低13.8%和40.5%。
(4)100μmol/L檳榔堿不影
7、響脂肪酸合成酶基因 Fas的表達(dá),但顯著降低Adrp和plin的mRNA水平。在誘導(dǎo)分化第3天和第11天,與對(duì)照組相比,檳榔堿處理組Adrp基因表達(dá)水平分別下降17.8%和5.1%;而 plin基因表達(dá)水平分別下降9.2%和15.0%。
(5)隨著3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟,脂肪細(xì)胞分化成熟基因 PPARγ2和Glut4的表達(dá)水平顯著升高,但100μmol/L檳榔堿可顯著降低PPARγ2和Glut4的表達(dá)。在誘導(dǎo)分化第3天
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