除蟲菊CPS基因的克隆及其轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、除蟲菊（Chrysanthemum cinerariaefolium）是一種菊科多年生草本植物，為天然殺蟲劑除蟲菊酯的原料作物。除蟲菊的殺蟲活性物質(zhì)除蟲菊酯（Pyrethrins）具有高效、廣譜、低毒、無污染等特點。隨著人們健康和環(huán)保意識的增強，許多發(fā)達國家高度重視除蟲菊的開發(fā)利用，市場需求不斷增長。但是除蟲菊酯在天然除蟲菊中的含量較低，為滿足日益增長的市場需求，開展除蟲菊酯生物合成途徑及其調(diào)控研究具有十分重要的意義。
　　菊酰焦

2、磷酸合成酶（Chrysanthemyl diphosphate synthase，CPS）是除蟲菊酯生物合成途徑中一個重要酶，它催化除蟲菊酯中環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的形成。本研究以“云除一號”除蟲菊的花蕾為材料，提取RNA并進行RT-PCR擴增，克隆了除蟲菊的菊酰焦磷酸合成酶基因；構(gòu)建了菊酰焦磷酸合成酶基因植物表達載體，并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CPS基因?qū)霟煵?，并初步探討了CPS基因在煙草中的表達，為今后在除蟲菊

3、中的應(yīng)用提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　?、偬崛〕x菊花蕾的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，并擴增出 CPS基因。CPS基因全長1188 bp，編碼395個氨基酸。通過生物信息學(xué)分析表明，此CPS蛋白能定位于葉綠體，具有質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽，還具有異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族成員所特有的2個天冬氨酸富集基序。
　?、趯U增的CPS基因，通過平末端連接的方式，構(gòu)建到載體pDH51中，經(jīng)酶切和PCR鑒定表明，已成功構(gòu)建了中間克隆載體pDH-CPSs和

4、pDH-CPSas。
　　③用限制性內(nèi)切酶從中間載體上切下兩端分別含有CaMV35S啟動子和35S終止子的CPS嵌合基因35SP-CPSs-35ST和35SP-CPSas-35ST的片段，將其插入到植物表達載體pCAMBIA1301的多克隆位點，從而構(gòu)建成帶有GUS報告基因的正義和反義植物表達載體pCAMBIA-CPSs和pCAMBIA-CPSas。
　?、懿捎脙鋈诜?，將重組質(zhì)粒 pCAMBIA-CPSs和pCAMBIA-C

5、PSas導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，在含有卡那霉素（Kan）的平板上篩選陽性克隆，并進行菌落PCR和提取質(zhì)粒、PCR擴增檢測，結(jié)果表明重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。
　?、莶捎萌~盤轉(zhuǎn)化法，以構(gòu)建的工程菌對煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化。在Kan50 mg/L的篩選壓下，取正常生根的煙草植株進行PCR檢測，并對檢測呈陽性的植株進行GUS活性檢測，證實目的基因已整合到煙草基因組中。取轉(zhuǎn)pCAMBIA-CPSs質(zhì)粒的植株葉片，提取總RNA，然