胰島素誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　胰島素是一類在人類胰腺中發(fā)現(xiàn)的分泌肽激素，它能提高葡萄糖的利用率。已有研究發(fā)現(xiàn)胰島素能誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞（小鼠成肌細(xì)胞，即肌前體細(xì)胞）增殖和肌細(xì)胞生成。胰島素如何誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚不明確。GATA-6是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。GATA-6在心肌細(xì)胞分化和保持血管平滑肌細(xì)胞分化表型中發(fā)揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)在脂類代謝如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和β-氧化中起著重要調(diào)節(jié)作用。GATA-6和PP

2、ARα是否參與胰島素對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)將是一項(xiàng)很有趣的研究。細(xì)胞凋亡受BCL-2家族蛋白（B-細(xì)胞淋巴瘤-2）的調(diào)節(jié)，BAD（細(xì)胞凋亡BCL-2促凋亡蛋白）是BCL-2家族成員之一，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CyclinD1是D型細(xì)胞周期蛋白的一種。能與CDK4和CDK6作用激活細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。但是有關(guān)cyclinD1和BAD在胰島素處理的C2C12細(xì)胞中的表達(dá)卻知之甚少。
　　方法
　　本研究中我們用MTT法、流式細(xì)胞分析、

3、細(xì)胞凋亡定量、DAPI染色、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、QuantitativeReal-TimePCR及WesternBlot實(shí)驗(yàn)來研究胰島素對(duì)C2C12細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的作用。
　　結(jié)果
　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10nM的胰島素處理C2C12細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.01)，而50nM和100nM的胰島素處理則誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞凋亡。與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)GATA-6能促進(jìn)C2C12細(xì)胞生長(P＜0.01)，這種促進(jìn)作用

4、在給予10nM胰島素處理后得到增強(qiáng)而50nM和100nM胰島素處理后該促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)。過表達(dá)GATA-6和PPARα雖然誘導(dǎo)細(xì)胞增殖但不能逆轉(zhuǎn)50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。
　　流式細(xì)胞分析表明10nM胰島素促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，50nM和100nM胰島素則將細(xì)胞周期阻滯在S期。過表達(dá)PPARα/GATA-6促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，在10nM胰島素處理時(shí)該促進(jìn)作用增強(qiáng)，而50nM和100nM胰島素處理時(shí)則逆轉(zhuǎn)該作用誘導(dǎo)細(xì)胞周

5、期阻滯。且PPARα和GATA-6均不能緩解50nM和100nM胰島素產(chǎn)生的該阻滯作用。
　　DAPI染色結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比50nM和100nM胰島素處理的細(xì)胞表現(xiàn)出較高水平的染色質(zhì)固縮，而10nM胰島素處理的細(xì)胞染色均勻未表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡后染色質(zhì)固縮。PPARα和GATA-6均不能逆轉(zhuǎn)50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡染色質(zhì)固縮。
　　熒光素酶報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明不同濃度胰島素分別誘導(dǎo)cyclinD1和BAD的

6、轉(zhuǎn)錄。10nM胰島素激活cyclinD1啟動(dòng)子活性，抑制BAD啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而50/100nM胰島素則激活BAD的啟動(dòng)子，抑制cyclinD1啟動(dòng)子活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GATA-6和PPARα均能增強(qiáng)cyclinD1啟動(dòng)子活性，逆轉(zhuǎn)50nM胰島素誘導(dǎo)的cyclinD1啟動(dòng)子活性的降低，卻不能逆轉(zhuǎn)100nM胰島素產(chǎn)生的作用。而且，GATA-6和PPARα均能抑制50nM和100nM胰島素誘導(dǎo)的激活BAD啟動(dòng)子活性的作用。

7、r>　　QuatitiveRealTime-PCR和WesternBlot分析發(fā)現(xiàn)10nM和50/100nM胰島素處理細(xì)胞分別誘導(dǎo)cyclinD1和BAD的表達(dá)。10nM胰島素處理誘導(dǎo)cyclinD1的表達(dá)(P＜0.01)，50/100nM胰島素處理則抑制cyclinD1的表達(dá)(P＜0.01)，促進(jìn)BAD的表達(dá)。在過表達(dá)GATA-6或PPARα的C2C12細(xì)胞中也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然過表達(dá)GATA-6的細(xì)胞中cyclinD1的表達(dá)