亞洲玉米螟對(duì)Cry1Ab的抗性遺傳規(guī)律及其中腸類鈣粘蛋白基因的克隆.pdf

1、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guen6e)是我國(guó)玉米的重要害蟲,表達(dá)CrylAb殺蟲蛋白的Bt玉米為玉米螟的防治提供了新的途徑.但是,實(shí)驗(yàn)室汰選研究已明確了亞洲玉米螟能對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性.深入研究玉米螟對(duì)CrylAb抗性遺傳規(guī)律和抗性產(chǎn)生的分子機(jī)制,對(duì)指導(dǎo)制定抗性治理計(jì)劃、建立快速靈敏的抗性分子檢測(cè)和監(jiān)測(cè)技術(shù)具有重要的意義.本文研究了亞洲玉米螟對(duì)CrylAb的抗性遺傳規(guī)律,克隆和比較了抗、感種群幼蟲中腸類鈣粘蛋白

2、的cDNA序列,獲得以下主要結(jié)果: 以亞洲玉米螟CrylAb抗性(RR)和敏感種群(SS)為材料,建立F<,1>-RS(早RR×♂ss)和sR(♂ss×♂RR)種群、同交Bcl(♂sR×♂ss)和Bc<,2>(♂Rs×♂ss)種群組成不同基岡型的種群譜系材料.室內(nèi)毒力生測(cè)結(jié)果表明各種群的LC<,50>分別為2.54(SS)、45.45(RR)、14.86(SR)、19.57(RS)、9.68(BCl)和9.60μg/g(BC2):IC<

3、,50>分別為0.29、5.32、2.14、2.37、1.18和0.91μg/g.依據(jù)LCso計(jì)算正反交的抗性基因顯性度分別為D=0.22、D<,Lc>=0.61和D=0.41、D<,Lc>=0.70,依據(jù)IC<,50>計(jì)算的顯性度分別為D=0.37、D<,Lc>c=0.68和D<,Lc>=0.43、D<,Lc>=0.71,并且SR和RS的LC<,50>和IC<,50>差異不顯著,毒力回歸線的 b 值差異也不顯著,表明SR和RS種群間的

4、抗性較水平一致,判斷亞洲玉米螟對(duì)CrylAb殺蟲蛋白的抗性是常染色體、不完全顯性遺傳.回交后代Bc<,1>和BC<,2>的實(shí)際曲線和期望曲線擬合的較好,實(shí)際值和期望值的t測(cè)驗(yàn)差異不顯著,對(duì)BC<,1>和BC<,2>的觀察值作適合性檢驗(yàn),x<'2>分別為8.68和8.36,小x<'2><,0.05>,證明亞洲玉米螟的抗性受單基因控制.利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)擴(kuò)增得到亞洲玉米螟幼蟲中腸類鈣粘蛋cDNA全序列J5570 bp,其CA、

5、C、G和T分別占25.9﹪、27.9﹪、26.0﹪和120.2﹪.開放閱讀框共5154bp,編碼1717個(gè)氨基酸,多為親水性氨基酸,5'端非編碼區(qū)長(zhǎng)222bp,3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)196bp,具有真核生物典型的polyA加尾,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為4.21,敏感與抗性種群分的子量分別為191.92 kDa和11192.03 kDa.由基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列具有典型的昆蟲類鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)特征,從N-端到C-端依次是21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列,11

6、個(gè)重復(fù)區(qū)、一個(gè)近膜區(qū)、23個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū)和具有126個(gè)氨基酸的胞質(zhì)區(qū),整個(gè)序列有14個(gè)N糖基化位點(diǎn).與其他昆蟲的類鈣粘蛋白的同源性>50﹪,其中與歐洲玉米螟O.nubilal&的同源性最高,達(dá)到99.0﹪,親緣關(guān)系最近,其次是二化螟Chilo suppressalis,與秋粘蟲spodopterafrugiperda、棉鈴蟲Hellcoverpa armigera和煙芽夜蛾Heliothis virescens的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

7、 抗、感種群類鈣粘蚩白核苷酸序列同一性為99.22﹪,氨基酸的同一性為99.24﹪,氨基酸的親脂性沒有人的差異.相對(duì)敏感種群,抗性種群共有40個(gè)堿基突變,導(dǎo)致13個(gè)氨基酸發(fā)生變化(K<'340>→E,C<'427>→Y,V<'542>→E,R<'1003>→Q<'1093>→P,H<'1253>→R,D<'1271>→Y,V<'1338>→I,D<'1379>→N,I<'1384>→T,T<'1457>→S,V<'1683>→I,