STAT6圈套ODN對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-13表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞,肥大細(xì)胞,T細(xì)胞,中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，反復(fù)發(fā)作性喘息,可逆性氣道狹窄和氣道重塑是其主要特征。依賴于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)持續(xù)活化與過度表達(dá)，使T細(xì)胞向Th2優(yōu)勢(shì)分化和Th2分泌IL-4,IL-5,IL-13等炎性介質(zhì)，是哮喘主要的病理生理基礎(chǔ)。本研究通過STAT6圈套寡核苷酸(ODN)和哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞的共同培養(yǎng)來觀察STAT6圈

2、套寡核苷酸(ODN)對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-13表達(dá)的影響。方法：(1)實(shí)驗(yàn)分組:將48只 BALB/c雌性小鼠分成兩組:Ⅰ組,正常小鼠8只;Ⅱ組,哮喘小鼠40只;其中Ⅱ組哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞分成5組:空白對(duì)照組(A組)、哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組(C組)哮喘圈套ODN組(D組)、哮喘無序ODN組(E組)。哮喘組用卵白蛋白(OVA)和氫氧化鋁建立哮喘模型,分別于第0、7、14天腹腔注射OVA致敏,第21天至28天霧化吸入5％OV

3、A激發(fā),每天一次,每次30分鐘。正常小鼠組以生理鹽水代替 OVA。(2)末次激發(fā)24小時(shí)后,處死小鼠收集肺泡灌洗液分別行白細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的分類計(jì)數(shù);HE染色肺組織切片觀察氣道炎癥變化。取出哮喘小鼠的脾臟,分離脾淋巴細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)并由陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染劑攜帶合成的全鏈硫代修飾的STAT6寡核苷酸(ODN)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,再用OVA激發(fā)淋巴細(xì)胞使其激發(fā)活化。24小時(shí)后離心收集培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞上清液并采用酶聯(lián)免疫吸附(ELI

4、SA)法測(cè)定其中的IL-13含量,離心后沉淀的細(xì)胞抽提總RNA逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)為cDNA,建立實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析IL-13mRNA的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差( sx±)表示,用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：(1)Ⅱ組與Ⅰ組比較,支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞均增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);(2)病理切片HE染色顯示:Ⅰ組支氣管上皮完整,杯狀細(xì)胞少見,基底層及平滑肌層較薄,

5、血管及氣道周圍見極少量炎癥細(xì)胞,支氣管管腔內(nèi)無大量分泌物;Ⅱ組氣管和血管周圍及肺泡隔內(nèi)見大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),氣道上皮細(xì)胞增生肥大,上皮不完整,上皮下基底層明顯增厚,氣管內(nèi)分泌物潴留,支氣管平滑肌增生(3)脾淋巴細(xì)胞IL-13mRNA的表達(dá)水平:空白組(A組)、哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組(C組)哮喘圈套ODN組(D組)、哮喘無序ODN組(E組)的淋巴細(xì)胞IL-13mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為:1.97253±0.17883、4.5

6、4200±0.51474、4.22287±0.29981、2.09736±0.20819、4.37192±0.31691。哮喘ODN組(D組)和空白組(A組)低于哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組(C組),哮喘無序 ODN組(E組)(P<0.01);哮喘ODN組(D組)和空白組(A組)間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);哮喘脂質(zhì)體組(C組)哮喘無序ODN組(E組)和哮喘OVA組(B組)之間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);4.脾

7、淋巴細(xì)胞上清液中IL-13的含量:空白組(A組)、哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組(C組)、哮喘ODN組(D組)、哮喘無序ODN組(E組)IL-13含量分別為:1.51093±0.10415、2.97970±0.12980、2.88808±0.08958、1.57130±0.10443、2.93010±0.10128。哮喘ODN組(D組)和空白組(A組)低于哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組(C組)和哮喘無序ODN組(E組)(P<0.

8、01)；哮喘ODN組(D組)和空白組(A組)間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；哮喘脂質(zhì)體組(C組)哮喘無序ODN組(E組)和哮喘OVA組(B組)之間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：用熒光顯微鏡觀察脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染FITC標(biāo)記的STAT6圈套ODN能順利進(jìn)入哮喘小鼠的脾淋巴細(xì)胞;STAT6圈套ODN能特異性抑制哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-13mRNA的轉(zhuǎn)錄和IL-13的分泌;脂質(zhì)體和無序ODN對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞表達(dá)IL