重組黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶在甲醇酵母中表達(dá)的改善和基于此的新型農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)傳感器的改進(jìn).pdf

1、基于酶抑制法原理的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法在我國(guó)應(yīng)用最為廣泛,但有兩點(diǎn)缺陷嚴(yán)重限制了其發(fā)展和進(jìn)一步應(yīng)用:首先,關(guān)鍵酶乙酰膽堿酯酶的靈敏度不能滿足越來(lái)越嚴(yán)格的檢測(cè)要求;其次,采用的光學(xué)分析手段易受色素等物質(zhì)干擾,測(cè)試范圍小。本文在已有基礎(chǔ)上,通過(guò)酵母密碼子優(yōu)化等,利用重疊PCR方法改造了黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶DmAChE cDNA序列,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了以AOX啟動(dòng)子的酵母表達(dá)載體pPIC9K/DmAChE,在通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化和MM平板快速篩選,進(jìn)而

2、獲得了一株高表達(dá)R-DmAChE菌株,其搖瓶培養(yǎng)條件下該重組酶可被分泌到培養(yǎng)基中,性達(dá)718 U/mL,相比我們已經(jīng)報(bào)道的未優(yōu)化密碼子時(shí)獲得轉(zhuǎn)化菌株的表達(dá)水平提高了3.4倍。在此基礎(chǔ)上,我們將獲得的高靈敏度重組乙酰膽堿酯酶用于電化學(xué)生物傳感器的研制,并在其中利用碳納米管來(lái)提高傳感器的性能。采用通過(guò)碳納米管介導(dǎo)電聚合普魯士藍(lán)作為電子傳遞媒介,可降低產(chǎn)生信號(hào)所需的氧化電壓至200 mV;酶的固定采用傳統(tǒng)可靠的戊二醛共價(jià)偶聯(lián)法。碳納米管憑借其

3、巨大的比表面積不僅增加了普魯士藍(lán)的聚合量,還將信號(hào)電流值提高了40％,并將信號(hào)平衡時(shí)間縮短了300%;此外,憑借碳管創(chuàng)造的特殊微環(huán)境,酶?jìng)鞲衅鞯臒岱€(wěn)定性得到了提高,對(duì)一些農(nóng)藥檢測(cè)靈敏度也顯著提高,如對(duì)克百威的檢測(cè)靈敏度提高了至少10倍。在4種加標(biāo)飲料種探測(cè)出0.5μg/L敵敵畏和5μg/L克百威,說(shuō)明該傳感器能夠抵抗糖、咖啡因、酒精、維生素和蛋白質(zhì)的干擾。因此,本文中獲得高表達(dá)量、高靈敏度的重組果蠅乙酰膽堿酯酶可為我國(guó)農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供優(yōu)