低溫誘導(dǎo)栽培番茄、多毛番茄和類番茄茄的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、有些植物在低溫環(huán)境下能提高自身的耐低溫能力，這個(gè)現(xiàn)象稱為低溫馴化，或冷馴化。植物應(yīng)對低溫環(huán)境的能力是不同的，適應(yīng)了溫帶環(huán)境的植物能夠在低溫環(huán)境中提高自身的耐低溫能力，而起源于熱帶和亞熱帶環(huán)境的植物（如番茄）不具備耐低溫能力。有研究表明，低溫調(diào)控基因在植物低溫應(yīng)答的分子機(jī)制中起到重要的作用，而且不同植物耐受低溫能力的差別很可能與低溫調(diào)控基因有關(guān)系。此外，也有研究表明，可變剪接(AS)在擬南芥、水稻和玉米等植物中有著廣泛的功能，同時(shí)也與這些

2、植物脅迫應(yīng)答有重要關(guān)系。MicroRNA（miRNA，或小RNA）也發(fā)現(xiàn)與植物器官發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)。栽培番茄、多毛番茄和類番茄茄是近緣物種，但它們的耐低溫能力卻有很大的差別，多毛番茄和類番茄茄比栽培番茄具有更強(qiáng)的耐低溫能力，但其耐低溫分子機(jī)制目前并不清楚。
　　在本研究中，以栽培番茄（glamor）作為不耐低溫材料的對照，利用轉(zhuǎn)錄組測序方法，初步解析了多毛番茄(LA1777)和類番茄茄(LA2408)兩種野生番茄的耐低溫分

3、子機(jī)制。利用高通量測序儀，我們在三個(gè)材料，三個(gè)低溫脅迫時(shí)間點(diǎn)（0小時(shí)、1小時(shí)和12小時(shí)）中，總共得到了大于200，000，000個(gè)測序讀長(Reads)，對這些Reads做了基因組定位，研究了差異表達(dá)基因(DEG)、可變剪接(AS)和MicroRNA（miRNA，或小RNA）等信息。我們對沒有基因組參考的多毛番茄和類番茄茄，進(jìn)行了基因序列的體外從頭組裝，結(jié)果分別得到了68，051和59，286個(gè)非重復(fù)基因片段，且保證所有組裝基因片段的長

4、度都大于200bp。
　　差異表達(dá)基因的結(jié)果表明，栽培番茄、多毛番茄和類番茄茄這三個(gè)材料，在低溫脅迫下，包括1小時(shí)和12小時(shí)后，都改變了基因的表達(dá)模式。在栽培番茄（不耐低溫材料對照）中，受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有1，256和3，350個(gè)基因上調(diào)（其中804個(gè)基因是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有）;有856和3，022個(gè)基因下調(diào)（其中339個(gè)基因是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有）。在多毛番茄中，受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有1，725和2，94

5、0個(gè)基因上調(diào)（其中722個(gè)基因是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有）;有1，967和3，126個(gè)基因下調(diào)（其中1，000個(gè)基因是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有）。在類番茄茄中，受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有617和1，928個(gè)基因上調(diào)（其中136個(gè)基因是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有）;有1，066和1，171個(gè)基因下調(diào)（其中185個(gè)基因是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有）。同時(shí)，我們挑選了一些差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，證明測序結(jié)果可靠，可用于進(jìn)一步分析。
　　為了研究多毛番茄的耐

6、低溫分子機(jī)制，我們利用DAVID分析平臺(tái)對多毛番茄和栽培番茄低溫調(diào)控基因進(jìn)行了功能聚類分析。在1小時(shí)低溫脅迫后，多毛番茄和栽培番茄低溫調(diào)控基因都在“非生物刺激應(yīng)答”這一類中顯示出高度富集。但是，與栽培番茄相比，多毛番茄低溫調(diào)控基因在“葉綠體相關(guān)”、“運(yùn)輸肽”、“三角狀五肽重復(fù)”、“苯丙烷代謝過程”、“黃酮代謝過程”和“氨基酸衍生物的生物合成過程”等類別中富集程度更高，而在“細(xì)胞壁代謝”、“幾丁質(zhì)等有機(jī)物應(yīng)答”和“DNA結(jié)合的WRKY”等

7、類別中，相比栽培番茄的富集程度更低。在12小時(shí)低溫脅迫后，多毛番茄和栽培番茄低溫調(diào)控基因都在“有機(jī)物應(yīng)答”和“激素刺激應(yīng)答”這一類中顯示出高度富集。但是，與栽培番茄相比，多毛番茄低溫調(diào)控基因在“UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶”等類別中富集程度更低。數(shù)據(jù)表明，冷耐受型番茄和冷敏感型番茄在低溫應(yīng)答的分子機(jī)制方面存在很大差別。
　　與類番茄茄不同，栽培番茄和多毛番茄與公布的番茄基因組序列相似度都大于70％，我們對其可以進(jìn)行可變剪接分析。結(jié)果表

8、明，在栽培番茄和多毛番茄中，共識(shí)別得到172，910個(gè)可變剪接，其中包含75，885個(gè)新可變剪接。在栽培番茄三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，分別識(shí)別得到105，663、109，251和102，316個(gè)可變剪接，其中包含21，548，25，492，22，870個(gè)新可變剪接;在多毛番茄三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，分別識(shí)別得到106，690、104，440和105，323個(gè)可變剪接，其中包含20，909，19，957和23，179個(gè)新可變剪接。其中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子保留是可變剪接

9、的主要類型。對低溫脅迫相關(guān)的可變剪接進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，在栽培番茄受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有131和575個(gè)可變剪接相應(yīng)基因傾向于發(fā)生可變剪接;有119和152個(gè)可變剪接相應(yīng)基因不傾向于發(fā)生可變剪接。在多毛番茄受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有114和606個(gè)可變剪接相應(yīng)基因傾向于發(fā)生可變剪接;有122和130個(gè)可變剪接相應(yīng)基因不傾向于發(fā)生可變剪接。同時(shí)，在栽培番茄受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有121和522個(gè)可

10、變剪接相應(yīng)基因上調(diào);有110和140個(gè)可變剪接相應(yīng)基因下調(diào)。在多毛番茄受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有112和553個(gè)可變剪接相應(yīng)基因上調(diào);有111和122個(gè)可變剪接相應(yīng)基因下調(diào)。
　　在本研究中，還識(shí)別了總共1，041個(gè)MicroRNA（miRNA，小RNA）的候選序列和靶基因。在栽培番茄中，受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有14和8個(gè)MicroRNA上調(diào);有7和6個(gè)MicroRNA下調(diào)。在多毛番茄中，受到低溫脅迫1小

11、時(shí)和12小時(shí)后，分別有2和4個(gè)MicroRNA上調(diào);有5和8個(gè)MicroRNA下調(diào)。在類番茄茄中，受到低溫脅迫1小時(shí)和12小時(shí)后，分別有151和59個(gè)MicroRNA上調(diào);有151和20個(gè)MicroRNA下調(diào)。同時(shí)，我們識(shí)別了MicroRNA的靶基因。根據(jù)MicroRNA與靶基因相反的表達(dá)量變化，結(jié)果表明，“sly-miR396a-靶基因Solyc07g041640.2”，“sly-miR5303b-靶基因Solyc09g009550.

12、2”，“sly-miR162-靶基因Solyc01g080500.2”，“sly-miR172a-靶基因Solyc03g044300.2”，“unconservative_ SL2.50ch00_3860-靶基因 c50426.graph_c0”，“sly-miR156a-靶基因c49736.graph_c0”等MicroRNA可能是低溫應(yīng)答相關(guān)“MicroRNA-靶基因通路”。結(jié)論:基因表達(dá)，MicroRNA和可變剪接的差異可能是栽培