一種新型殼聚糖聚合物在骨組織工程中的實驗研究.pdf

1、目的:制備一種新型的殼聚糖聚合物—水凝膠，并使其具備以下功能和特性:對細胞分裂增值有促進作用;可成為多種細胞、藥物、生物活性物質的載體;能作為活性組織細胞生長的支架;促進骨組織再生愈合。
　　方法:1）以天然殼聚糖、明膠為原料，先按多種配比與化學交聯(lián)劑京尼平、離子交聯(lián)劑甘油-2-磷酸二鈉進行雙重交聯(lián)，再把可在符合初始設計要求規(guī)定時間范圍內成膠的殼聚糖水凝膠樣品制備成多個不同配比的水凝膠細胞培養(yǎng)基，然后對所有培養(yǎng)基樣品進行骨髓間充質

2、干細胞接種，最后以相差顯微鏡觀察水凝膠培養(yǎng)基中生長情況為標準，初步篩選出適合細胞生長的殼聚糖水凝膠制備方案。2）選用多種常用的骨生物工程材料檢測方法對初篩制備出的水凝膠進行理化特性方面檢測，包括對水凝膠進行表面電鏡掃描、振蕩剪切流變學、體外釋放動力學檢測，測定剛度及表面結構。在生物學特性檢測方面，對水凝膠細胞巢細胞培養(yǎng)進行熒光染色激光共聚焦掃描、細胞活力增殖實驗、細胞誘導遷移實驗、實時PCR測定人骨髓間充質干細胞成骨基因的表達、免疫組化

3、法測定ALP表達，以及新西蘭大白兔橈骨缺損修復模型實驗，根據細胞生長狀態(tài)及體內外成骨特性，進一步篩選出更好的水凝膠配比。
　　結果:1）通過水凝膠理化特性檢測和體內外成骨實驗的篩選實驗，篩選后的水凝膠制備流程和配比為:1.85％殼聚糖溶液、純水、1.8％明膠溶液，按4∶1∶1比例混勻攪拌30Min后加熱至35℃，再加入濃度為50mmol/8ul、體積比35∶1的京尼平溶液化學交聯(lián)20Min，再加入濃度0.8g％ml、體積比160∶

4、1的甘油-2-磷酸二鈉離子交聯(lián)劑混勻攪拌5Min實現(xiàn)離子交聯(lián)過程，放置37度溫箱孵育120Min。2）水凝膠表面電鏡掃描顯示，水凝膠表面呈多孔網狀結構，孔表面欠光滑，孔徑隨水凝膠中京尼平濃度的增加而逐漸增大。水分子含量高，利于液體交換，可提供適合細胞生長的微環(huán)境。3）流變學檢測中發(fā)現(xiàn)，水凝膠剛性模量變化范圍在0.1437±0.0100kPa和3.5787±0.3200kPa之間;粘彈性模量在0.0026±0.0005kPa和0.0150

5、±0.0085 kPa之間。水凝膠原位成膠的時間在10-133Min之間。隨著京尼平濃度的增加，水凝膠原位成膠速度加快，成膠明顯縮短，剛性模量G'(Kpa)增加、粘彈性模量G”(Kpa)增加。配比4-1+ Nx(12x，16x，8x)成膠時間、表面剛度更符合要求。4）激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，所有配比為4-1+ Nx系列的水凝膠培養(yǎng)基均能支持細胞正常增殖、分化。配比為4-1+12x的水凝膠，細胞分化、生長狀態(tài)最好，細胞增殖速度最快。

6、5）采用ELISA法檢測到攜載不同濃度rhBMP-2的水凝膠均有良好的體外釋放動力學效果，所有濃度的水凝膠載體均能穩(wěn)定持續(xù)地釋放不同濃度的BMP-2，早期表現(xiàn)為爆發(fā)性釋放，7天后呈持續(xù)穩(wěn)定的緩慢釋放，28天時仍達6.40％±0.55％。釋放濃度、釋放速度與載體BMP-2原始濃度呈正相關。6）接種于水凝膠培養(yǎng)基中的人骨髓間充質干細胞采用MTT法觀察發(fā)現(xiàn)實驗組第1-7天的增殖速度明顯超過對照組，且增殖峰值提前。7)采用小室法觀察法觀察細胞遷

7、移實驗顯示，所有攜載活性誘導因子rhBMP-2的水凝膠培養(yǎng)基對人骨髓間充質干細胞都有誘導作用，但不同rhBMP-2濃度的水凝膠載體對同種細胞，誘導作用不同，實驗組中rhBMP-2濃度500ng/ml的水凝膠載體，誘導作用最強。8）實時PCR檢測培養(yǎng)于攜帶不同濃度BMP-2的水凝膠上的人骨髓間充質干細胞成骨基因mRNA的表達時發(fā)現(xiàn)，所有攜載BMP-2的實驗組與空白對照組相比，低濃度的BMP-2對人骨髓間充質干細胞成骨基因的表達即有顯著的促

8、進作用，隨攜載濃度增加促進作用加強。9）在新西蘭大白兔橈骨骨缺損模型的體內動物實驗中，術后4周、8周、12周成骨情況觀察，X線照片、micro-CT掃描三維重建成像及特殊成骨染色三個方面均顯示:攜帶BMP-2及自體成骨細胞的水凝膠實驗組與對照組相比有明顯統(tǒng)計學差異、實驗組在骨形成及修復方面有明顯優(yōu)勢。
　　結論:制備、篩選出了新型水凝膠，以生物工程材料評價方法對其理化特性、體、內外生物學特性進行檢測、評估，認為其制備方案及流程合理