ChIFN-α-ChIL-2嵌合基因的構建、融合表達及生物學活性研究.pdf

1、雞的病毒性疾病種類多、危害大，當前，缺乏高效廣譜的抗病毒藥物可用；為了研究高效、廣譜、無殘留、無污染、不產生耐藥性的基因工程抗病毒藥物，解決當前獸醫(yī)臨床上無高效廣譜抗病毒藥物可用的技術問題，本研究進行了雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因的構建、融合表達及生物學活性研究。 首先設計含雙酶切位點的引物采用RT-PCR方法自羅曼雞脾臟總RNA擴增、克隆雞白細胞介素-2(Chicken interleukin-2，ChIL-2)成熟肽基因

2、；采用重疊延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)技術將雞a干擾素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)和ChIL-2成熟肽基因序列通過一基因柔性linker(G4S)3連接，構建重組嵌合基因(ChIFN-α-linker-ChIL-2)并克隆入pGEM-T easy克隆載體，篩選ChIFN-α-linker-ChIL-2，ChIL-2陽性重組質粒并經

3、限制性內切酶雙切后連接入經相同酶切的pQE-30表達載體中以構建重組表達載體pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2、pQE-30/ChIL-2，將以上重組表達載體及以前已構建成功的pQE-30/ChIFN-α轉化入E.coli.JM109中并采用IPTG誘導表達。分別對表達的重組ChIFN-α蛋白(rChIFN-α)、重組ChIL-2蛋白(rChIL-2)、重組融合ChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白(rCh

4、IFN-α-linker-ChIL-2)采用尿素變性、復性液復性、PBS溶液透析等方法進行純化。采用細胞病變抑制法分別檢測rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、單一rChIFN-α蛋白在雞胚成纖維細胞(Chicken Embryo Fibroblasts，CEF)上抗水泡性口炎病毒(VSV)活性；采用MTT法和ChIL-2 ELISA試驗方法分別檢測rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中rChIL-2的含量、單-

5、ChIL-2蛋白對ConA刺激的雞T淋巴細胞增殖活性及與抗ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應的活性。分別測定rChIFN-a-linker-ChIL-2蛋白在SPF雞胚上對新城疫強毒株(NDV)和禽流感H9N2株(AIV H9N2)抑制活性以測定其在雞胚內抗病毒活性。分別測定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白對NDV活疫苗和滅活疫苗的免疫增強作用以測定其在雞體內的抗病毒活性及ChIL-2蛋白的疫苗免疫增強活性。 結

6、果表明： 克隆了ChIL-2成熟肽基因，全長363bp，編碼121個氨基酸；表達的rChIL-2蛋白分子量大小約為16.3kD左右；經純化后蛋白純度在95％以上。采用SOE-PCR方法成功構建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因及其pQE-30重組表達載體(pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2)，對其測序結果表明重組表達質粒中插入的ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因全長909b

7、p，編碼300個氨基酸，插入方向正確，核苷酸序列無變異。表達的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小約35.9kD，與預期大小相一致;蛋白經純化后純度在96％以上?；钚匝芯拷Y果表明：rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在細胞上具有明顯的抗病毒活性，其在CEF細胞上的抗VSV活性單位(9.36×107IU/mg)，明顯高于單一rChIFN-α的抗病毒效價(4.09×105IU/mg)。最低劑量為250pg的

8、rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可對Con A活化的雞T淋巴細胞具有明顯的增殖活性，隨著劑量的增加，rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白對雞T淋巴細胞的增殖活性逐漸增強；rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應，計算rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2蛋白的相對含量約為8.12×10-7mg/mL，說明rChIFN-α-linker-

9、ChIL-2蛋白中的ChIL-2蛋白具有免疫學生物活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF雞胚內可明顯減輕NDV強毒株和AIV H9N2毒株所引起的胚體出血，并能顯著延長雞胚存活時間，表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在雞胚內具有明顯的抗病毒活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白對NDV滅活疫苗具有顯著的免疫增強作用，但對NDV活疫苗免疫增強作用不明顯，表明rChIFN-α-lin

10、ker-ChIL-2蛋白在雞體內既具有抗病毒活性，同時也具有IL-2的免疫增強作用。以上結果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在雞體內外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的雙重生物學活性。 本研究成功構建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因，并對其進行了融合表達和純化；純化后的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在細胞上和雞體內均具有抗病毒活性和ChIL-2蛋白的雙重生物學活性，