亞洲玉米螟免疫相關(guān)模式識別受體基因β-1,3-GRP的cDNA克隆及表達分析.pdf

1、為研究亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)幼蟲體內(nèi)一種與免疫相關(guān)的模式識別受體β-1，3-葡聚糖識別蛋白(βGRPs)表達調(diào)控的分子機理，本文利用RACE技術(shù)從亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)克隆得到β-1，3-GRP的cDNA序列，對β-1，3-GRP基因序列進行了生物信息學(xué)分析，摸索了原核表達β-1，3-GRP蛋白的條件。對亞洲玉米螟5齡幼蟲進行細菌注射，通過熒光定量實時PCR檢測注射前后β-1，3-GRP基因在不同組

2、織中mRNA水平上的表達變化情況。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)采用RT-PCR及RACE技術(shù)從亞洲玉米螟幼蟲中克隆β-1，3-GRP基因全長cDNA序列。該基因全長1570 bp核苷酸(GenBank登錄號:KF425324)，包含一個1452 bp的開放閱讀框(ORF)，一個14bp的5'非編碼區(qū)(5'UTR)和一個104bp的帶有加尾信號的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。開放閱讀框從第15個核苷酸開始，終止于第1469個核苷酸，

3、起始密碼子ATG，終始密碼子TGA，由其推導(dǎo)的氨基酸序列以甲硫氨酸為起始氨基酸，長為484個氨基酸。Of-β-1，3-GRP蛋白的計算分子量約為53.37 kDa，估測等電點pI為6.46。生物信息學(xué)分析表明:β-1，3-GRP蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，N端含有信號肽，切割位點為25與26位氨基酸之間，有2個糖基化位點，分別位于139位和141位，含有44個磷酸化位點，均勻分布于整個多肽鏈中。BlastP分析結(jié)果表明:Of-β-1，3-GRP的

4、氨基酸序列與棉鈴蟲Helicoverpaarmigeraβ-1，3-GRP3、家蠶Bombyx moriβ-1，3-GRP2、煙草天蛾Manduca sexta GNBP、煙草天蛾M.sextaβ-1，3-GRP3、玉帶鳳蝶Papilio polytes革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白3、柑橘鳳蝶Papilio xuthus革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白3高度同源。
　　(2)采用pET-28b原核表達系統(tǒng)對β-1，3-GRP蛋白進行了原核表達，結(jié)果顯

5、示，Of-βGRP重組蛋白在IPTG的梯度誘導(dǎo)之后在沉淀中均有大量表達，重組表達蛋白質(zhì)分子的大小與預(yù)測蛋白分子量大小一致，約為53 kDa。pET-28b-β-1，3-GRP在28℃溫度下，可以明顯看到1.0 mmol/L和1.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下碎菌上清中有明顯的蛋白表達。
　　(3)通過Real time PCR檢測注射后不同時間(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24 h、36 h)β-1，3-GRP

6、基因在亞洲玉米螟幼蟲不同組織（血細胞、中腸、脂肪體、體壁）中的表達變化。結(jié)果表明:血細胞中，注射后6h，生理鹽水組、枯草芽孢桿菌組和大腸桿菌組β-1，3-GRP表達水平均開始上升(p＜0.05)。12h后，大腸桿菌處理組和枯草芽孢桿菌組β-1，3-GRP表達水平都達到峰值，隨著時間延長，表達量開始急劇下降。在中腸和脂肪體中，三個處理組β-1，3-GRP表達平均呈先增后降的趨勢，但在中腸中，大腸桿菌處理組表達水平變化趨勢較枯草芽孢桿菌處理

7、組明顯，在脂肪體中二者差異不明顯。在中腸組織中，β-1，3-GRP作為一種響應(yīng)革蘭氏陰性菌表面β-1，3-葡聚糖的受體，對大腸桿菌的響應(yīng)要較革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌快。在體壁組織中，與對照組相比，生理鹽水組β-1，3-GRP基因表達水平變化不大，枯草芽孢桿菌細組β-1，3-GRP基因表達水平4h時達到峰值，之后緩慢下降，而大腸桿菌組β-1，3-GRP基因表達水平2h時達到峰值，之后緩慢下降?？傮w來說，不同組織β-1，3-GRP基因?qū)Ω锾m