21-羥化酶缺陷癥基因診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　通過(guò)熒光偏振檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合直接測(cè)序法，建立一種針對(duì)21-羥化酶缺陷癥進(jìn)行基因診斷的新方法，并用新建立的檢測(cè)體系對(duì)中國(guó)人群中21-羥化酶缺陷癥最常見(jiàn)的2種基因缺失和8種基因點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該體系的準(zhǔn)確性及臨床可實(shí)施性，并對(duì)檢測(cè)到的基因突變進(jìn)行分析，探討基因型與臨床表型之間的關(guān)系。
　　方法：
　　收集40例正常人及3例21-羥化酶缺陷癥患者外周血，提取基因組DNA。設(shè)計(jì)通用引物，同時(shí)擴(kuò)增 CYP21A2和C

2、YP21A1P等位基因片段，然后用擴(kuò)增產(chǎn)物與特異的 TAMRA熒光標(biāo)記探針?lè)謩e進(jìn)行雜交，利用熒光偏振儀檢測(cè)雜交產(chǎn)物的熒光偏振值(FP)，從而確定是否存在該基因的缺失，同時(shí)用直接測(cè)序法驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果；對(duì)Exon3 Del8bp(GAGACTAC)缺失進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，為確保引物特異性，將缺失的8個(gè)堿基設(shè)計(jì)在引物上，同時(shí)根據(jù) CYP21A2基因與其假基因 CYP21A1P部分序列之間的差異，設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物用于擴(kuò)增CYP21A2基因，PCR后直接

3、測(cè)序檢測(cè)中國(guó)人群中21-羥化酶缺陷癥最常見(jiàn)的8種基因點(diǎn)突變，即P30L、i2g、I172N、E6Cluster、V281L、920-921insT、Q218X、R356W突變。
　　結(jié)果：
　　熒光偏振法未檢測(cè)到CYP21A2基因大片段缺失，檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序法一致率達(dá)100％。40例正常人均無(wú)點(diǎn)突變，21-羥化酶缺陷癥患者中1例檢測(cè)出 G56R、c.920-921InsT雜合突變，2例檢測(cè)出I172N、Q318X雜合突變。