亞洲落葉松八齒小蠹伴生真菌致病性及特異性檢測.pdf

1、落葉松屬植物（Larix spp.）在我國分布廣泛，是我國速生豐產(chǎn)用材林的重要樹種。亞洲落葉松八齒小蠹(Ips subelongatus Motschulsky)是一種危害落葉松的蛀干害蟲，主要分布于我國東北和華北地區(qū)。作為我國林業(yè)危險性有害生物，危害枯立木和健康樹種，對落葉松林造成了巨大的損失。小蠹蟲與真菌能夠形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，伴生真菌對于削弱寄主樹木抗性、協(xié)助小蠹蟲侵害樹木、維護(hù)小蠹蟲種群密度等方面起著重要的作用，其中許多伴生真菌

2、是具有強(qiáng)致病力的重要植物病原物?；谏鲜稣撌觯_展本項研究，以期為有效控制落葉松八齒小蠹的危害提供理論依據(jù)。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上選擇了落葉松八齒小蠹伴生真菌區(qū)系中的優(yōu)勢種(Ophiostoma kryptum,Endoconidiophora fujiensis,O.cf.bicolor,O.brunneociliatum)，人工接種于華北落葉松（L.prineipis-rupprechtii）成年（40年生）植株上，模

3、擬小蠹蟲侵入寄主的方式，采用高密度接種方法和低密度接種方法進(jìn)行致病性的測定。結(jié)合前人研究結(jié)果和致病性研究結(jié)果，根據(jù)Harrington等人的方法將來自華北落葉松、長白落葉松和興安落葉松的E.fujiensis和O.kryptum的菌株人工接種于分布在不同地區(qū)的三種落葉松及日本落葉松上進(jìn)行致病力差異測定。根據(jù)致病性結(jié)果對強(qiáng)致病力真菌進(jìn)行快速特異性的檢測。同時對分布在不同地區(qū)的長白落葉松，興安落葉松和華北落葉松三種森林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生的八齒小

4、蠹的蟲體和坑道組織進(jìn)行伴生真菌的分離純化，進(jìn)行生理學(xué)特性、菌落特征、微觀形態(tài)學(xué)的觀察，以及多位點DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了落葉松八齒小蠹伴生真菌區(qū)系中Graphium屬和Leptographium屬真菌組成。
　　對伴生菌優(yōu)勢種致病性測定結(jié)果表明，O.kryptum的致病力最強(qiáng)，E.fujiensis次之，O.cf.bicolor和O.brunneociliatum致病力較弱。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)寄主為興安落葉松的E.fujie

5、nsis菌株在華北落葉松上的致病性，明顯弱于寄主為華北落葉松的菌株在其上的致病性，證明不同寄主的E.fujiensis菌株致病力可能存在差異。并且在中國落葉松上分離的O.kryptum菌株致病力與前人研究中寄主為歐洲落葉松的O.kryptum菌株致病力結(jié)果不同，說明其可能存在致病力差異。通過進(jìn)一步對E.fujiensis和O.kryptum致病力差異測定，研究發(fā)現(xiàn)來自不同寄主的O.kryptum菌株對4種落葉松致病力差異不大，而來自分布

6、在不同地區(qū)的3種落葉松寄主的E.fujiensis菌株致病力存在差異，其中來自華北落葉松的菌株致病力最強(qiáng)，來自長白落葉松的菌株次之，來自興安落葉松的菌株最差。表明菌株在致病性上具有致病性分化特征，結(jié)合前期的多基因序列研究，E.fujiensis可能存在著寄主長期脅迫下的種下分化現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來自中國3種落葉松的E.fujiensis的所有菌株對日本落葉松的致病力大于對中國本地落葉松的致病力，對日本落葉松表現(xiàn)為強(qiáng)致病菌，與日本國內(nèi)的

7、測定結(jié)果相一致，而O.kryptum菌株對中國本地落葉松和日本落葉松致病力相同，說明E.fujiensis對日本落葉松具有強(qiáng)致病力。相比日本落葉松的感病性，我國本地落葉松與病原的協(xié)調(diào)進(jìn)化過程中演化出了穩(wěn)定的抗病性。
　　通過形態(tài)學(xué)鑒定和基于ITS2-LSU、β-tubulin和TEF-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，分離到Leptographium屬真菌3種，其中2種為新種，分別定名為Leptographiumzhangense Li

8、u,Lu&Zhang sp.nov.和Leptographium innermongoliaae Liu,Lu&Zhangsp.nov.，另外1種是L.taigense，系首次在中國發(fā)現(xiàn)。L.zhangense，屬于Leptographiumpiceiperda種復(fù)合體，在系統(tǒng)發(fā)育分析中與L.piceaperda和L.aenigmatica具有較近的親緣關(guān)系，而在形態(tài)上與L.laricis相似，二者相比子囊頸長寬度和子囊孢子的形狀大小存

9、在差異。L.innermongoliaae與L.taigense親緣關(guān)系較近，二者形態(tài)上都具有synnematous無性型。兩個新種分別從菌落特征、生長速率、分生孢子等方面與現(xiàn)有Leptographium屬種形態(tài)近似種區(qū)分。3種Leptographium屬真菌均在寄主為興安落葉松的韌皮部分離得到，為亞洲落葉松八齒小蠹與長喙殼類真菌的新伴生關(guān)系。
　　通過形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，共分離到Graphium屬真菌2種:G.larici

10、s和G.carbonarium，其中G.laricis為中國新紀(jì)錄種。G.laricis和G.carbonarium都屬于G.penicillioides種復(fù)合體，二者都是首次從亞洲落葉松八齒小蠹上分離到，與落葉松八齒小蠹形成新的小蠹蟲-真菌伴生關(guān)系，并且增加了兩種真菌的寄主種類，擴(kuò)大了其分布范圍和寄主的種類。
　　基于對落葉松八齒小蠹伴生菌區(qū)系和致病性的研究，選擇強(qiáng)致病力優(yōu)勢種O.kryptum和E.fujiensis對其進(jìn)行快

11、速特異性PCR檢測，分別篩選出特異性引物對OK1/OK2和CFU1/CFU2。引物對OK1/OK2對于O.kryptum菌株均表現(xiàn)有1條248bp的清晰明亮條帶，而其他菌種則無該條帶。引物對CFU1/CFU2對于E.fujiensis菌株均表現(xiàn)有1條251bp的清晰明亮條帶，而其他菌種則無該條帶。使用特異性引物能夠直接從木塊標(biāo)本的混合DNA中檢測出O.kryptum和E.fujiensis，縮小了工作時間，提高工作效率并且還能檢測費用低