人Ap4A水解酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和嗜肺軍團(tuán)菌RpoS克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)研究.pdf

1、1.人Ap4A水解酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究
　　二腺苷四磷酸(Ap4A)存在于從古細(xì)菌到人類的所有活細(xì)胞中，并一直被認(rèn)為是原核生物和真核生物的胞內(nèi)警報分子。在細(xì)胞內(nèi)，它影響DNA修復(fù)、RNA編程、細(xì)胞分化、熱激和氧分壓、凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物過程。因此Ap4A的水平必須受到嚴(yán)格調(diào)控。
　　Ap4A水解酶（非對稱性二腺苷四磷酸水解酶，EC3.6.1.17）負(fù)責(zé)水解Ap4A，因此參與上述所有的生物過程。最近的證據(jù)表明SARS-CoV7a

2、蛋白與人源Ap4A水解酶相互作用，并可能共同參與導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的途徑。Ap4A水解酶屬于Nudix水解酶超家族，發(fā)揮活性依賴Mg2+，催化核苷二磷酸基團(tuán)的水解，包含了保守的Nudix序列GX5EX7REUXEEXGU（U代表一個疏水氨基酸殘基，通常是Ile、Leu或者Val，X代表任何殘基），特點(diǎn)是從結(jié)合腺苷部分切開多磷酸鹽鏈的第四位磷酸基團(tuán)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，Ap4A化水解酶被分為動物-古細(xì)菌類型和植物-細(xì)菌類型兩類。對兩

3、類Ap4A水解酶結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)這些酶均含有一個αβα-sandwich結(jié)構(gòu)的Nudix折疊，但動物-古細(xì)菌類型和植物-細(xì)菌類型酶的底物結(jié)合位點(diǎn)存在重要的差異。
　　在這篇文章中，我們解析了人源Ap4A水解酶E58A突變體與底物分子的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，這對于了解這類酶的底物結(jié)合模式可能具有重要的意義。
　　2.嗜肺軍團(tuán)菌RpoS的克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)研究
　　嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila

4、，L.pneumophila）是一種革蘭氏陰性菌，它侵染人肺泡組織后能引起致命性的肺炎（Legionnaires' disease，軍團(tuán)病或嗜肺軍團(tuán)菌肺炎）。L.pneumophila在宿主細(xì)胞內(nèi)的生活周期分為兩個階段:在人肺泡細(xì)胞中的大量增殖階段（指數(shù)期）和對其他細(xì)胞的感染階段（穩(wěn)定期）。L.pneumophila在宿主胞內(nèi)的增殖是一個有序的過程，需要感應(yīng)大量的信號并對其做出反應(yīng)，表明這個過程包含了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。L.pneumo

5、phila的一組基因（dot/icm:defective for organelle trafficking/intracellular multiplication）編碼的Dot/Icm分泌系統(tǒng)（簡稱Dot/Icm系統(tǒng)）與typeⅣ分泌系統(tǒng)同源，其組分幾乎參與了L.pneumophila在宿主胞內(nèi)寄生的所有方面，比如介導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞、胞內(nèi)復(fù)制、LCV(Legionella-containing vacuole)的形成、抑制宿主細(xì)胞的凋

6、亡等等。L.pneumophila在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖還受到另外兩個“雙組分系統(tǒng)”的調(diào)控:CpxRA(conjugation plasmid expression regulator/A)/PmrAB(polymyxin-resistant A/B)系統(tǒng)直接調(diào)控Dot/Icm系統(tǒng)的底物基因的轉(zhuǎn)錄，LetAS(Legionella transmissionactivator/sensor)系統(tǒng)則正調(diào)控影響指數(shù)后期嗜肺軍團(tuán)菌表型基因的表達(dá)。Rp

7、oS位于CpxRA/PmrAB和LetAS這兩個“雙組分系統(tǒng)”調(diào)控通路的上游，間接調(diào)控L.pneumophila在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖。
　　研究表明嗜肺軍團(tuán)菌中的RpoS(L.pneumophila RNA polymerase sigmafactor，L.pneumophila RpoS)影響L.Pneumophila胞內(nèi)增殖所需的多條通路的相關(guān)基因的表達(dá)。另外，L.pneumophila RpoS在同源蛋白與DNA結(jié)合的區(qū)域缺少