黃鰭鯛骨骼肌中肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白的純化及抗體制備.pdf

1、肌聯(lián)蛋白(Titin)和伴肌動蛋白(Nebulin)是兩種分子量分別為3000 kDa和1600—900 kDa的大分子量肌原纖維結(jié)構(gòu)蛋白。由于這兩種大分子量蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征以及在肌原纖維中的位置，最新研究認(rèn)為它們可能在肌肉彈性的形成中起重要作用。本研究以海水魚黃鰭鯛(sparus latus)為研究對象，旨在分離純化Titin和Nebulin，制備特異性多克隆抗體，并研究這兩種蛋白在不同貯藏條件下的自身降解及其酶解作用，為進(jìn)一步研究

2、水產(chǎn)動物大分子量肌肉結(jié)構(gòu)蛋白的生物化學(xué)和食品學(xué)性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 用Sephacryl S-400凝膠過濾柱層析和電洗脫等方法對海水黃鰭鯛骨骼肌中的Titin和Nebulin進(jìn)行分離純化，并結(jié)合免疫印跡法進(jìn)一步確認(rèn)Titin。結(jié)果顯示：從黃鰭鯛肌肉中分離純化了高純度的Titin，并與小鼠抗雞Titin單克隆抗體發(fā)生明顯的免疫交叉反應(yīng)；通過電洗脫法純化得到了電泳純度的Nebulin。 以提純的Titin和Nebulin為抗原分

3、別免疫大鼠和新西蘭家兔，制備大鼠抗黃鰭鯛Titin多克隆抗體和兔抗黃鰭鯛Nebulin多克隆抗體。結(jié)果顯示：對大鼠抗黃鰭鯛Titin多克隆抗體，ELISA法檢測效價(jià)約為1×10<'5>，免疫斑點(diǎn)印跡法檢測效價(jià)至少為5×10<'4>；Western—blot檢測大鼠抗黃鰭鯛Titin多克隆抗體與肌原纖維蛋白中的Titin發(fā)生特異反應(yīng)，而與其他蛋白無免疫交叉反應(yīng)。對兔抗黃鰭鯛Nebulin多克隆抗體，免疫斑點(diǎn)印跡法檢測效價(jià)至少為5×10<'

4、4>；Western—blot檢測兔抗黃鰭鯛Nebtllin多克隆抗體與肌原纖維蛋白中的Nebulin能發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其他蛋白僅有微弱免疫交叉反應(yīng)。 通過對在4℃和18℃下放置不同天數(shù)的黃鰭鯛肌肉、表皮色澤、眼睛清澈度、氣味等感官鮮度指標(biāo)觀察并結(jié)合SDS-PAGE分析，探明Titin和Nebulin在貯藏過程中的分解變化。結(jié)果顯示：4℃貯藏條件下黃鰭鯛肌肉的軟化、腐臭等感官鮮度指標(biāo)下降較慢；而18℃貯藏條件下則明顯較快；S

5、DS—PAGE顯示4℃下即使冷藏11天Titin變化不顯著，11天后逐漸發(fā)生降解。第7天Nebulin開始發(fā)生降解。但在18℃貯藏1天Titin和Nebulin即開始降解，第5天幾乎檢測不到Nebulin，第7天檢測不到Titin，可見肌肉結(jié)構(gòu)蛋白Nebuhn比Titin更易降解，但魚體死后肌肉彈性的下降與這兩種大分子量蛋白降解之間關(guān)聯(lián)性不是很密切。 以肌原纖維和純化蛋白為對象，研究在55℃、20℃和4℃下肌原纖維結(jié)合型絲氨

6、酸蛋白酶(myofibrill-bound serine proteinase，MBSP)對Titin和Nebulin的分解作用。結(jié)果表明：55℃下MBSP對Titin和Nebulin有明顯的分解作用且對Nebulin的分解強(qiáng)于Titin。而在20℃和4℃這樣較低溫度下，MBSP對Titin和Nebulin也有輕微的分解作用。 本研究首次從魚體肌肉中純化得到了Titin和Nebulin這兩種大分子量蛋白，并制備得到了這兩種蛋白高