豬脂肪沉積三個候選基因的分子生物學基礎研究.pdf

1、本文主要在分子和細胞水平上研究了豬脂肪沉積代謝相關的三個候選基因。脂肪甘油三酯脂酶(AdiposeTriglycerideLipase,ATGL)是2004年由幾個不同的實驗室采用不同的方法相繼發(fā)現(xiàn)的一種新的甘油三酯水解酶,官方命名為PNPLA2,又名為iPLA2ζ,desnutrin,TTS2.2和PEDF-R等。該酶主要水解甘油三酯(TG)的第一酯鍵產(chǎn)生甘油二酯(DAG),然后激素敏感脂肪酶(HSL)降解甘油二酯為游離脂肪酸(FFA

2、)。因此,ATGL與HSL一起協(xié)同消耗哺乳動物體內(nèi)儲存的脂肪。脂聯(lián)素(Adiponectin,Acrp30)首次發(fā)現(xiàn)于1995年,現(xiàn)在研究證明它是機體的脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控網(wǎng)絡中的重要調(diào)節(jié)因子。Adiponectin由脂肪細胞分泌后進入血液,以多種形式在血液中循環(huán)。脂聯(lián)素球狀區(qū)在體內(nèi)獨立存在,與完整的脂聯(lián)素功能相似。脂聯(lián)素能夠促進肌肉脂肪酸氧化、降低血漿甘油三酯、通過增強胰島素的敏感性而促進葡萄糖代謝。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人脂聯(lián)素基因的多態(tài)

3、性與肥胖、胰島素敏感性和2型糖尿病有關。抵抗素(Resistin,RSTN)首次發(fā)現(xiàn)于2001年,是一種典型的脂肪細胞因子。Resistin的重要生理作用就是將肥胖與胰島素抵抗聯(lián)系起來,其進一步深入研究對于預防、檢測和治療2型糖尿病具有重要指導意義。
　　 鑒于ATGL在脂質(zhì)代謝和脂肪沉積中的重要作用,我們針對豬ATGL基因開展了對分子水平上的研究,包括全長cDNA和DNA的分離、mRNA組織表達譜分析、多態(tài)性位點的檢測與遺傳效

4、應分析、啟動子活性分析、融合蛋白表達定位及轉染細胞克隆篩選等。同時,我們還選取豬脂聯(lián)素和抵抗素基因為脂肪沉積和胴體性狀的重要候選基因,重點開展了序列分離和有效分子標記鑒定的工作。關于豬ATGL、Acrp30和RSTN基因的研究,初步的結果如下:
　　 1.豬ATGL基因
　　 (1)全長cDNA的克隆與鑒定。結合EST序列拼接和cDNA末端快速擴增的方法,獲得了豬ATGL基因的全長cDNA序列。發(fā)現(xiàn)豬ATGL基因編碼區(qū)為

5、1461bp,編碼486個氨基酸(aa),分子量大小為53.2kDa,等電點為7.90。與其它物種一樣,豬ATGL蛋白N端預測含patatin脂肪酶結構域,同時含絲氨酸酯酶的α/β水解酶折疊結構和催化二元組基序(GXSXG和DXG/A),對應的活性殘基為Ser47和Asp166;物種間同源性比較發(fā)現(xiàn)豬ATGL與牛、狗、小鼠、大鼠、人同源性較高(＞83％)且遺傳進化關系距牛最近。
　　 (2)全長基因組DNA的分離與鑒定。結合染色

6、體步移獲得豬ATGL基因全長基因組DNA序列7044bp。結合物種間同源比較發(fā)現(xiàn)該基因含9個編碼外顯子,且所有的內(nèi)含子和外顯子的拼接都符合GT/AG規(guī)則。
　　 (3)啟動子序列的獲得及生物信息學分析。利用基因組步移法擴增得到豬ATGL基因5’側翼998bp的序列。利用NNPP、MotifFinder、TFSEARCH、CPGPLOT、SignalScan等軟件對該基因的核心啟動子、轉錄起始位點、CpG島的分布以及與啟動子相結合

7、的轉錄因子進行了預測和分析,發(fā)現(xiàn)翻譯起始密碼子ATG上游164bp處為轉錄起始,204bp到155bp之間存在核心啟動子,同時預測到含有帽子信號、TATA框、GC盒、CAAT和GATAs等順式元件和CREBP1、MyoD、C/EBP等轉錄因子結合位點。另外,在ATGL基因的上游調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)2處突變。
　　 (4)染色體精細定位。利用豬-倉鼠輻射雜交克隆板定位(IMpRH)成功將豬ATGL基因定位于SSC2p17(LOD=10.26

8、),即SSC2p末端,而該區(qū)剛好存在一個影響背膘厚的QTL。
　　 (5)多態(tài)位點的掃描。以瘦肉型豬種(大約克夏、長白、杜洛克豬等)和脂肪型中國地方豬種(梅山豬等)為研究材料,掃描ATGL基因在不同豬種的序列遺傳變異,發(fā)現(xiàn)了編碼區(qū)序列存在11處單核苷酸變異。
　　 (6)G392A突變的遺傳效應分析。發(fā)現(xiàn)patation保守結構域內(nèi)第392位核苷酸G/A突變(G392A),導致第131位的Arg/His變異(R131H)

9、。通過建立一種快速靈敏的引物突變和PCR-RFLP法在不同群體中對該位點的等位基因頻率分布進行掃描,發(fā)現(xiàn)該位點在大白和長白豬中A等位基因占優(yōu)勢,頻率分別為73％和80％；而脂肪型梅山豬中G等位基因占優(yōu)勢(73％)。遺傳效應分析發(fā)現(xiàn)該位點與幾乎所有的脂肪相關檢測性狀都極顯著或顯著相關,包括皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪相關性狀、瘦肉率、眼肌性狀、肋骨數(shù)等。根據(jù)TOPpred軟件預測發(fā)現(xiàn),該突變可能位于鄰近第三跨膜區(qū)(141-161aa)的膜內(nèi)區(qū)(64

10、-140aa)；而且該突變又是位于patation功能域內(nèi),所以R131H突變極有能對ATGL的空間結構或激活水平產(chǎn)生影響。
　　 (7)組織轉錄表達譜。利用熒光實時定量RT-PCR技術進行ATGL基因mRNA表達譜分析,發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織中超高量特異表達,肌肉、小腸和心臟中等表達,而在肝、脾、肺、胃、腎和卵巢中幾乎檢測不到表達。
　　 (8)啟動子活性分析。構建了7個含豬ATGL基因翻譯起始上游序列的不同缺失片段的熒光素

11、酶報告基因表達載體,分別為pGL3-Q1(-998bp～+45bp)、pGL3-Q2(-788bp～+45bp)、pGL3-Q3(-631bp～+45bp)、pGL3-Q4(-568bp～+45bp)、pGL3-Q5(-472bp～+45bp)、pGL3-Q6(-367bp～+45bp)和pGL3-Q7(-198bp～+45bp),用Lioofectamine2000瞬時轉染COS-7細胞株,48小時后雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在生物發(fā)

12、光儀中檢測。結果分析表明,最小核心啟動子區(qū)于-367bp～-164bp處,-568b～-367bp存在正調(diào)控元件,-788bp～-568bp存在負調(diào)控元件。
　　 (9)融合蛋白表達。構建了不同缺失蛋白的EGFP融合表達載體pATGL/EGFP、pATGL-pat/EGFP、pATGL-Npat/EGFP、pATGL-Fab/EGFP和pHSL/EGFP,轉染豬腎細胞系IBRS-2和豬原代脂肪細胞,并對轉染后蛋白的表達在激光共聚

13、焦顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)只有完整的HSL和ATGL蛋白才定位于細胞質(zhì),而其他三個ATGL缺失蛋白與EGFP融合表達的產(chǎn)物彌散分布于整個細胞中。
　　 (10)G418篩選細胞克隆。確定本實驗室IBRS-2細胞的最佳G418篩選濃度為800μg/mL。經(jīng)G418篩選和有限稀釋法反復篩選成功獲得綠色熒光蛋白分別與ATGL和HSL融合表達的IBRS-2細胞克隆(pATGL/EGFP、pHSL/EGFP),能在體外連續(xù)傳代過程中持續(xù)表達綠色

14、熒光。
　　 2.關于豬Acrp30的分子標記篩選
　　 (1)外顯子2的178bp處存在A/G變異。該位點引起異亮氨酸(Isoleucine)和纈氨酸(Valine)的變異,并引起內(nèi)切酶AcyⅠ的酶切多態(tài)性。利用AcyⅠPCR-RFLP的方法,對五個品種豬(國外品種大白、長白和杜洛克豬,國內(nèi)品種梅山和清平豬)進行了基因型分型。結果發(fā)現(xiàn)國內(nèi)品種脂肪型豬中A等位基因占絕大多數(shù),而檢測的國外純種瘦肉型豬中全都是B等位基因。為

15、檢測該多態(tài)性與脂肪相關性狀值間的關系,在267頭“大白×梅山”F2資源群體中進行與胴體性狀的關聯(lián)分析。結果發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與眾多脂肪沉積和胴體性狀顯著相關。G等位基因頻率的增加,有利于增加眼肌面積、瘦肉率和骨率,減少肩部最厚處背膘厚、6-7腰椎背膘厚、胸腰椎間背膘厚和臀部背膘厚等。A178G(Ile60Val)的變異位于豬脂聯(lián)素膠狀區(qū)的第60位氨基酸,可能影響到其高級結構的形成,進而影響到翻譯后修飾和多聚體的生物學活性。豬脂聯(lián)素基因該功

16、能性位點的首次發(fā)現(xiàn)為該基因作為脂肪沉積相關性狀重要候選基因進一步提供了依據(jù)。
　　 (2)內(nèi)含子2中第958位的A/G突變。用PCR-SSCP檢測了三個品種豬的基因型分布,發(fā)現(xiàn)檢測的國內(nèi)品種梅山豬中都為G等位基因,而國外品種大白和長白豬中都為A等位基因。在273頭“大白×梅山”F2資源家系群體中進行統(tǒng)計分析表明,A等位基因有利于增加眼肌寬、眼肌面積和瘦肉率,并減少肩部背膘厚、6-7腰椎間背膘厚和平均背膘厚。
　　 3.關

17、于抵抗素的分子標記篩選
　　 發(fā)現(xiàn)318-331bp處的14bp插入/缺失突變,設計引物在大白、長白和梅山等純種和大梅F2群體中擴增出含該位點的482/468bp的PCR產(chǎn)物,并通過非變性8％聚丙烯酰胺凝膠電泳對該位點多態(tài)性的分布進行分析。絕大部分都為缺失純合型(AA)和雜合型(AG),插入突變占少數(shù)。其中,國外品種大白和長白都為缺失純合型(AA),國內(nèi)品種梅山有三種基因型。在127頭“大白×梅山”F2資源群體中進行與胴體性狀的