脂肪酶構(gòu)象刻錄及催化能力考察.pdf

1、本文首次闡述了一種新型固定化酶——“刻錄酶”的制備方法。和普通固定化酶相比，首先，它在制備過程中加入了配體誘導(dǎo)酶構(gòu)象；其次，最終制備得到的刻錄酶構(gòu)象是剛性化的。文中對(duì)刻錄酶的整個(gè)制備流程進(jìn)行了摸索，重點(diǎn)討論了它在水相和有機(jī)相中的催化活性、穩(wěn)定性以及在有機(jī)相中的吸附配體能力，最后利用SEM對(duì)刻錄酶載體進(jìn)行了宏觀表征。 以聚乙二醇200(400)二(甲基)丙烯酸酯4種不同的功能單體和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為聚合原料，脂肪酶為模板

2、分子，加入配體月桂酸對(duì)脂肪酶進(jìn)行活性構(gòu)象誘導(dǎo)，再通過紫外光引發(fā)聚合以及無水有機(jī)溶劑索式抽提月桂酸后，獲得了4種鎖定脂肪酶活性構(gòu)象的聚合物，即刻錄脂肪酶聚合物。在以無水丙酮為洗脫劑時(shí)獲得了最高86.31％的月桂酸洗脫率，且脂肪酶的洗脫量保持在一個(gè)較小范圍。當(dāng)單體和交聯(lián)劑以質(zhì)量比為2：1，紫外光照聚合時(shí)間為45s時(shí)，所得四種刻錄酶都表現(xiàn)出了優(yōu)異的抗溶脹穩(wěn)定性，尤其在正庚烷和水中為最佳。這些都基本符合對(duì)“刻錄酶”載體性能的預(yù)期設(shè)想。

3、論文對(duì)刻錄酶在水相和有機(jī)相的催化特性進(jìn)行了探索。水相催化采用橄欖油水解法，發(fā)現(xiàn)四種刻錄酶都具有較好的活性和穩(wěn)定性。它們在水相中最佳催化時(shí)間為15min，活性最大在Da(聚乙二醇400二丙烯酸酯為單體的刻錄酶)上獲得(6.07U/g)，活性收率高達(dá)171％；同時(shí)經(jīng)過比較，發(fā)現(xiàn)含有甲基的單體聚合時(shí)容易形成超支化聚合物，增大反應(yīng)時(shí)的傳質(zhì)阻力，造成其活性和活性收率都大大降低；四種刻錄酶在強(qiáng)酸(pH=2.42)、強(qiáng)堿(pH=12.00)和高溫(8

4、0℃)下均可以分別保持它們初始活性的75％、50％和70％以上，其中Da在160℃左右完全失活，這是因?yàn)檩d體在153℃開始熱不穩(wěn)定造成的；用沉淀變性劑和溶解變性劑分別浸泡刻錄酶30d后，四種刻錄酶仍然可以表現(xiàn)出它們初始活性的50％和45％以上。這說明脂肪酶構(gòu)象的高度剛性化對(duì)它在水相催化時(shí)的活性和穩(wěn)定性都是非常有利的。有機(jī)相催化選用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化反應(yīng)體系，以活性最大的Da為考察對(duì)象，發(fā)現(xiàn)它在有機(jī)相催化中活性較為低下。40℃時(shí)催

5、化24h活性為15.30U/g，升溫至50℃可以小幅度提升Da活性為16.67U/g，而此時(shí)活性僅為固體酶粉的46.88％；但刻錄酶優(yōu)異的穩(wěn)定性在有機(jī)相中繼續(xù)得以體現(xiàn)。經(jīng)過5次連續(xù)的循環(huán)抽提和催化反應(yīng)后，刻錄酶仍然可以殘留91.04％的初始活性。在進(jìn)一步研究中顯示，通過加入致孔劑甲苯減少傳質(zhì)阻力的方法無法提升酶活性，因?yàn)榧妆饺菀资褂坞x酶失活，而直接提高正庚烷中的含水量卻可以大幅度提高酶活性。當(dāng)正庚烷的水含量為1％(v/v)時(shí)刻錄酶活性為

6、最大，40℃時(shí)催化24h活性達(dá)38.23U/g，是無水時(shí)活性的2.49倍。但隨著正庚烷中含水量的繼續(xù)增加，刻錄酶活性不斷下降，至10％(v/v)時(shí)完全失活。這說明水引發(fā)的刻錄酶柔性對(duì)酶活性提高有至關(guān)重要的作用，保持脂肪酶活性構(gòu)象的同時(shí)增加些許柔性可以獲得最為理想的活性效果。40℃在水含量為1％(v/v)的正庚烷酯化體系中，刻錄酶催化的酯化反應(yīng)過程還基本符合雙底物Ping-Pong理論所描述的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制，其動(dòng)力學(xué)方程可表示為ν=20.

7、390[A][B]31.220[B]+1.086[A]+[A][B]。 實(shí)驗(yàn)還對(duì)Da的吸附配體能力做了考察。對(duì)月桂酸濃度為200μmol/mL的正庚烷溶液進(jìn)行吸附，發(fā)現(xiàn)Da對(duì)配體月桂酸顯示出了一定的吸附能力。在40℃下它的平衡吸附量為30.22(mg·g-1)，較30℃提高1.35倍，吸附收率為70.46％，此時(shí)的吸附速率常數(shù)為0.024(mg·g-1·min-1)，吸附動(dòng)力學(xué)行為符合Langmuir速率方程；加入致孔劑甲苯可以

8、提高Da的月桂酸吸附量，40℃下平衡吸附量提高為40.04(mg·g-1)，吸附收率達(dá)93.35％，此時(shí)的吸附速率常數(shù)為0.033(mg·g-1·min-1)，且吸附動(dòng)力學(xué)行為也符合Langmuir速率方程。但和有機(jī)相催化不一致，水的加入不利于Da的吸附過程，在40℃，當(dāng)正庚烷中含水量為0.5％(v/v)時(shí)，Da的平衡吸附量下降1倍，至5％(v/v)時(shí)基本沒有吸附能力。這說明水引發(fā)的刻錄酶柔性改變了它的剛性吸附位點(diǎn)，減弱了吸附作用。