蜈蚣三七有效成分W-,3-的半合成及抗腫瘤活性的研究.pdf

1、目的:蜈蚣三七(曾用名地烏)系毛莨科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花的干燥根莖，其性溫，味辛微苦具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、消腫止痛之功效，善治風(fēng)濕疼痛、跌打損傷。湖北中醫(yī)學(xué)院中藥研究所由蜈蚣三七中得到蜈蚣三七提取物，制成地烏風(fēng)濕安膠囊，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，與2004年9月2日獲國(guó)家五類中藥新藥的臨床研究批件，現(xiàn)處于3期臨床實(shí)驗(yàn)階段。地烏風(fēng)濕安膠囊通過(guò)實(shí)驗(yàn)投入生產(chǎn)后，可預(yù)見(jiàn)其原料臨床需求量會(huì)不斷增加。由于蜈蚣三七原植物林蔭銀蓮花生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、分

2、布海拔高、人工栽培較困難，通過(guò)化學(xué)合成其藥用活性成分蜈蚣三七皂苷W3是解決林蔭銀蓮花植物資源匱乏的重要策略之一。人工合成方法與從植物中分離蜈蚣三七皂苷W3相比，具有不受資源限制、方法簡(jiǎn)便、成本低、耗時(shí)短、適宜于規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。
　　 大量實(shí)驗(yàn)研究證明，毛茛科銀蓮花屬植物有較好的抗腫瘤活性，本課題將用合成的蜈蚣三七皂苷W3、蜈蚣三七皂苷、齊墩果酸三種藥物，分別作用于人肝癌Hep3B細(xì)胞、Hel人胚肺細(xì)胞，進(jìn)行體外抗腫瘤研究，探討

3、中藥成分或單體的作用機(jī)理，驗(yàn)證合成的W3與蜈蚣三七皂苷具有相似甚至更好的活性，為進(jìn)一步研究蜈蚣三七成分的藥理學(xué)毒性及開(kāi)發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
　　 利用葡萄糖(C6H12O6)、L-鼠李糖(C6H12O5)、D-木糖(C5H10O5)、齊墩果酸(C30H48O3)等單糖制得化合物1(2，3-二-0-乙?；?4，6-0-芐叉-β-D-葡萄糖乙硫苷)，化合物6(2，

4、3，4，6-四-0-乙?；?β-D-葡萄糖對(duì)甲氧基苯酚氧苷)，化合物4(2，3，4-三-0-苯甲酰基-α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亞胺酯)，化合物11(3，4-二-0-乙?；?1，2-0-原甲酸酯-α-D-吡喃木糖)，化合物17(齊墩果酸三苯基甲基酯)。再以化合物1、4、6、11和17為原料，采用匯聚式路線，完成W3的半合成。
　　 二.合成的W3抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)
　　 1.藥物分組：本實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組，分別為蜈蚣三七總苷、合

5、成的W3以及齊墩果酸，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性藥物對(duì)照組(順鉑)、DMSO(二甲基亞砜)組、空白對(duì)照組(未加藥組)。
　　 2.采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組對(duì)Hep3B細(xì)胞、Hel細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
　　 3.倒置顯微鏡觀察各組藥物作用于Hep3B細(xì)胞、Hel細(xì)胞48h后的形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組藥物作用后Hep3B細(xì)胞細(xì)胞周期分布和凋亡率。

6、>　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0分析，用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，X2檢驗(yàn)對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如有差異，多組間參數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。(1)Y軸為細(xì)胞存活率，X軸為藥物濃度，制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。(2)利用公式計(jì)算細(xì)胞48小時(shí)細(xì)胞增殖抑制率。(3)通過(guò)EXCEL畫圖法做趨勢(shì)線來(lái)求48小時(shí)IC50值。
　　 結(jié)果:
　　 一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
　　 完成蜈蚣三七有效成

7、分W3的合成，純度達(dá)到90％。
　　 二.合成的W3抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)
　　 1.不同濃度不同藥物分組的藥物作用于體外培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞、Hel細(xì)胞48h后，各實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)抑制率結(jié)果如下：
　　 1.1 Hep3B細(xì)胞：合成的W3、蜈蚣三七總苷、齊墩果酸均對(duì)Hep3B細(xì)胞有增殖抑制作用。
　　 1.2 Hel細(xì)胞：W3、蜈蚣三七總苷均對(duì)Hel細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞抑制作用。
　　 2.藥物作用后，Hep3B

8、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下觀察到：
　　 2.1空白對(duì)照組：Hep3B細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，彌散蔓延分布，呈紡錘形或多角形，細(xì)胞透亮，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　 2.2DMSO組：DMSO作用于Hep3B細(xì)胞與空白對(duì)照組比較生長(zhǎng)情況無(wú)明顯的差異。
　　 2.3W3組：細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞相互分離，透亮度差，貼壁大量減少，細(xì)胞體積明顯縮小，變圓，可見(jiàn)大量細(xì)胞崩解碎片，細(xì)胞核縮小或崩解消失，核染色質(zhì)邊聚，可見(jiàn)裸露的核。以中劑量

9、組效果最好。
　　 2.4蜈蚣三七總苷組：細(xì)胞數(shù)量減少，體積變小，收縮變圓，可見(jiàn)裸露的核，細(xì)胞腫脹，形成空泡。以高劑量組效果較好。
　　 2.5齊墩果酸組：細(xì)胞數(shù)量減少，體積變小，收縮變圓。效果略遜于蜈蚣三七總苷。
　　 2.6順鉑組：細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞破壞形成碎片，細(xì)胞溶解，可見(jiàn)裸露的細(xì)胞核。
　　 3.電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
　　 3.1空白對(duì)照組：可見(jiàn)Hep3B細(xì)胞包膜完整，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)

10、胞器分布均勻，線粒體大小均勻，細(xì)胞核清晰，核膜完整。
　　 3.2 W3組：細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞核擠向一邊，染色質(zhì)深染，聚集成團(tuán)，胞漿濃縮，細(xì)胞質(zhì)萎縮，細(xì)胞器腫脹變形，擁擠，細(xì)胞膜破裂，絨毛消失，細(xì)胞肌漿網(wǎng)明顯擴(kuò)張呈巨大空泡狀，線粒體退行性變，腫脹、結(jié)構(gòu)破壞，嵴紊亂、稀疏。
　　 3.3蜈蚣三七總苷組：可見(jiàn)細(xì)胞核收縮，核質(zhì)濃縮邊聚。細(xì)胞病變明顯輕于W3組。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep3B細(xì)胞的凋亡率。體外培養(yǎng)的H

11、ep3B細(xì)胞經(jīng)W3藥物高劑量作用后細(xì)胞碎片及早期凋亡細(xì)胞較空白對(duì)照組高。經(jīng)W3藥物中劑量作用后可見(jiàn)大量的細(xì)胞碎片及早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞也高于空白對(duì)照組。經(jīng)W3藥物低劑量作用后可見(jiàn)大量的細(xì)胞碎片。經(jīng)蜈蚣三七總苷中劑量作用后出現(xiàn)了晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞及早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞百分率明顯高于空白對(duì)照組，經(jīng)齊墩果酸高劑量作用后可見(jiàn)大量的細(xì)胞碎片。
　　 結(jié)論:
　　 1.本課題所采用的W3半合成

12、路線有效可行。
　　 2.W3、蜈蚣三七總苷、齊墩果酸均對(duì)Hep3B細(xì)胞的有增殖抑制作用。對(duì)Hel細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞抑制作用。
　　 3.形態(tài)學(xué)變化(光鏡、電鏡)：W3中劑量的Hep3B細(xì)胞毒效果最好，蜈蚣三七總苷次之，母核齊墩果酸再次之。
　　 4.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep3B細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果說(shuō)明W3其作用機(jī)制可能主要與殺傷Hep3B細(xì)胞及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。蜈蚣三七總苷其作用機(jī)制可能主要與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。母核齊