角膜內(nèi)皮增殖和電紡膜構(gòu)建角膜內(nèi)皮層的研究.pdf

1、第一部分、嘌呤核苷酸促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖及相關(guān)機(jī)制研究
　　目的：探索嘌呤核苷酸促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞（corneal endothelial cells，CECs）增殖的作用及相關(guān)信號通路
　　方法:
　　1.分離培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，CCK-8和Ki-67免疫熒光染色檢測不同濃度AT P(1μM,10μM,25μM,50μM，and100μM)對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　2.CCK-8檢測不同濃度UTP(1

2、μM,10μM,25μM,50μM,and100μM)對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　3.CCK-8檢測多種嘌呤受體激動劑、抑制劑，PI3K-AKT通路抑制劑對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　4.Western blot檢測各種嘌呤核苷酸及抑制劑對P2Y2-PI3K-AKT通路中關(guān)鍵蛋白AKT磷酸化的影響。
　　結(jié)果:
　　1.10μM ATP促兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果最佳，25μM ATP效果次之。
　　

3、2.大于等于10μM濃度的UT P都能促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　3.多種P2Y2受體激動劑也能促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖，非P2Y2受體激動劑不能促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖，P2Y2受體抑制劑和P2Y2-P I3K-AKT通路抑制劑能阻斷ATP的促增殖效果。
　　4.各濃度AT P都能促進(jìn)P2Y2-P I3K-AKT中關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化，并且磷酸化持續(xù)1小時以上。多種P2Y2受體激動劑也能促進(jìn)AKT的磷酸化，P2Y2受體抑制

4、劑和P2Y2-PI3K-AKT通路抑制劑能則阻斷磷酸化作用，起到抑制增殖的作用。
　　結(jié)論:ATP及P2Y2受體激動劑作用于P2Y2受體后激活P2Y2-P I3K-AKT通路，促進(jìn)AKT磷酸化從而促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
　　第二部分、SF/P（LLA-CL）混合電紡膜應(yīng)用于角膜內(nèi)皮層構(gòu)建的研究
　　目的:初步探討絲素蛋白(SF)與聚乳酸己內(nèi)酯(P(LLA-CL))混合靜電紡絲膜在角膜內(nèi)皮層構(gòu)建中的作用
　　方

5、法:
　　1.從蠶蛹中分離提純絲素蛋白,與P(LLA-CL)進(jìn)行不同比例混合（100:0,75:25,50:50,25:75,0:100），靜電紡絲制備納米薄膜材料。
　　2.掃描電鏡檢測不同比例的靜電紡絲薄膜材料的表面形態(tài)及納米纖維直徑。測量不同比例薄膜材料的親水角、機(jī)械強度及透光率。
　　3.將人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系HC EC-B4G12細(xì)胞接種到不同比例的薄膜材料上，檢測細(xì)胞在不同比例材料上的黏附速度、細(xì)胞活力與增殖能

6、力以及材料的細(xì)胞安全性。
　　4.將HC EC-B4G12細(xì)胞接種到薄膜材料上進(jìn)行長時間培養(yǎng)，檢測內(nèi)皮細(xì)胞呈單層生長情況，細(xì)胞間緊密連接形成情況及內(nèi)皮功能相關(guān)蛋白基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.不同比例SF與P(LLA-CL)混合后都能電紡絲形成白色薄膜材料。
　　2.不同比例混合靜電紡絲膜表面納米纖維直徑不同，純SF纖維最細(xì)，純P(LLA-CL)纖維最粗；親水角隨著P(LLA-CL)含量增高而增加；25:

7、75,0:100兩個比例電紡膜機(jī)械性能最佳；25:75比例電紡膜透光率最佳。
　　3.電紡膜的納米纖維表面能有效促進(jìn)HC EC-B4G12細(xì)胞的黏附，內(nèi)皮細(xì)胞在各個比例混合的電紡膜中細(xì)胞活力良好，電紡膜對細(xì)胞無毒性，其中25:75比例電紡膜對細(xì)胞的增殖影響最小。
　　4.各個比例混合的電紡膜上HC EC-B4G12細(xì)胞都能正常生長，并且呈單層生長，細(xì)胞間連接形成良好，大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)無變化，材料局部降解會增加碳